第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第三节 氨基酸的测定.pptVIP

介绍离心薄层色谱仪： 1. LBG — 1型离心薄层色谱仪 北京产 2. 7924型离心薄层色谱仪 美国Harrison 公司研制 3. CLC — 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达 10g 。 二．氨基酸自动分析仪法 三．气相色谱法 四．高效液相色谱法 习题： 1、氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 2、TLC法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。 第三节 氨基酸的测定 一、氨基酸的一般定量测定 二、氨基酸的分离与测定 目的：掌握氨基酸分离、测定的原理和方法。 氨基酸的定量测定 一．氨基酸的一般定量测定 （一）甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，与 —NH2— 结合，碱性消失，再； 用强碱来滴定 —COOH 基。 2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定） 3．双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液， ③ 0.1%中性红pH 6.8(红)～8.0(黄)50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4．操作：同时取两份样： ① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。 ② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。 二者之差可计算氨基酸含量 百里酚酞是一种酸碱指示剂，变色范围是：PH 9.3无-10.5兰与酚酞的变色范围不同：无色——PH=8.2——红 注意事项 １此法适用于测定食品中的游离氨基酸。 ２固体样品应选进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液，液体试样如酱油饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。 ３若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。 （二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570 nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。 （三）氨基酸自动分析仪法 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 可同时测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10 pmol。 注意事项： (1)样品中氨基酸的含量在1.00g/100g以下，保留两位有效数字；含量在1.00g/100g以上，保留三位有效数字。 (2)16种氨基酸相对分子质量；天冬氨酸133.1；苏氨酸119.1；丝氨酸105.1；谷氨酸147.1；脯氨酸115.1；甘氨酸75.1；丙氨酸89.1；缬氨酸117.2；蛋氨酸149.2；异亮氨酸131.2；亮氨酸131.2；酪氨酸181.2；苯丙氨酸165.2；组氨酸155.2；赖氨酸146.2；精氨酸174.2。 (3)标准出峰顺序和保留时间见表11-2，标准图谱如图11-4所示。 序号 出峰顺序 保留时间(min) 序号 出峰顺序 保留时间(min) 1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.63 2 苏氨酸 6.60 10 异亮氨酸 21.24 3 丝氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.06 4 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.52 5 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.76 6 甘氨酸 12.24 14 组氨酸 30.41 7 丙氨酸 13.10 15 赖氨酸 32.57 8 缬氨酸 16.65 16 精氨酸 40.75 (4)本法为国家标准食物中氨基酸的测定方法，适用于食物中的16种氨基酸的测定，最低检出限为10 pmol。但本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定。 氨基酸标准图谱 二．氨基酸的分离与测定 （一）薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比