基因工程3大肠杆菌表达系统.pptVIP

③产物特异性不强。应减少引物量及提高退火温度、减少Mg2+浓度。 ④出现引物二聚体条带。首先检查引物是否存在3’端互补的问题，如果无此问题，应减少引物量及循环次数。提高原始模板量及退火温度。 ※ 实验操作中要注意防止DNA污染，那怕是痕量的也要防止。操作时要戴一次性的手套。所用的器皿，离心管、吸头等均应使用新的，并要经过高压灭菌。盛有PCR试剂的小离心管打开前应用离心机轻离一下，使试剂沉到管底，这样做可防止取液时手套、移液器对试剂的污染。如有条件，整个操作都应在超净工作台中进行。 ※ 实验结果的分析要慎重，由于PCR的灵敏度极高，同时植物基因组又大又复杂，对扩增出的条带要进行认真的分析，以区分出特异性扩增及非特异性扩增。 漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离的探针。 最后根据探针的标记性质进行检出，特异性杂交体的数量及位置将清晰而准确地显示出来。 实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA样品及待检转化植株总DNA样品。 2）Southern印迹杂交的实验样品 ※阳性对照样品：①含被检的外源基因的中间载体质粒DNA；或②农杆菌共整合载体的Ti质粒DNA；或③农杆菌双元载体小质粒DNA。 ※阴性对照样品：用相同方法提取的非转化植株总DNA。 ※分子量标准DNA样品：?DNA／HindⅢ、或?DNA／HindIII+EcoR I。 ※被检样品：各转化克隆植株总DNA。 3）Southern印迹杂交的实验程序 Southern印迹杂交需要依次完成如下8个实验步骤：①植物总DNA的限制性酶切；②凝胶电泳分离各酶切片段；③各酶切片段于凝胶中原位变性；④将凝胶中变性的DNA片段转移到固相膜上；⑤预杂交，掩盖非特异性位点；⑥探针与膜上同源DNA片段杂交；⑦漂洗去除未结合的及非特异性结合的探针；⑧杂交体检出。 各程序中有关问题阐述如下： ① 植物总DNA的限制性酶切 * 限制性内切酶的选择 多数情况是对植物基因组DNA进行单酶切，也可进行双酶切。酶的选用原则是消化后生成的DNA片段可提供出与探针杂交所需的足够信息，即限制片段中必须含有整个探针序列。 ② 酶切反应体系 * 植物DNA的用量一般在5～15μg； * 酶切体积为20一50μl； * 酶的用量要比消化质粒DNA时高一些，一般为5～10U/μg DNA。 Notice: 限制性内切酶是保存在50％的甘油中，如果酶切反应体系中甘油浓度超过5％，则会引起限制性内切酶专一性改变，产生星活性。 ③ 酶切效果检验 酶切体系及条件是否合适，需通过检测酶切效果来确定。 酶切充分的植物DNA产生若干大小不同的片段。将酶切样品用％或％的琼脂糖凝胶分离，电泳后在紫外灯下观察，酶切效果好的样品应呈现出一条连续的，荧光由深至浅的均匀条带(高分子量区深，低分子量区浅) 。 ④ 凝胶中的DNA变性 Southern杂交必须是单链探针与单链同源DNA片段结合，因而凝胶上的双链DNA片段必需经变性处理，使之成为单链。通常采用碱变性，将凝胶浸泡在／L NaOH、NaCl溶液中，室温下于脱色摇床上轻摇，其间可更换一次变性液以使DNA充分变性，注意胶不要浮在液面上。 ⑤ 印迹 Southern杂交是杂交液中的探针与固定在固相支特物上的同源序列进行的固—液杂交。固相支持物也称固相膜或简称为膜。将凝胶上的变性DNA片段原位转移到固相支持物上的过程称为印迹。为满足印迹及杂交操作的要求，固相膜必需具有如下特点： ※ 能很好地与DNA分子结合，要求每平方厘米能结合10μg以上的DNA，同时又不影响DNA片段与探针杂交；※ 对探针及其它物质的非特异性吸附小； ※ 具良好的机械性能。 印迹方法 第一、毛细转移法：该方法是利用干燥吸水纸的毛细作用进行转移。 第二、电转移法：电转移法是利用电泳的原理，凝胶上的DNA片段在电场作用下脱离凝胶，原位转至固相支持物上。 第三、真空转移法：真空转移原理是利用真空作用造成流经凝胶的液流，使凝胶中的DNA片段洗脱出来而沉积在凝胶下面的固相支持物上。 ⑥ 预杂交 *预杂交：预杂交是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点。由于固相膜对单链DNA有很强的结合力，所以膜不仅能与印迹过去的样品DNA结合，而且也能与探针结合。在印迹后的膜上，除样品占据的位置外还有空余，如不将这些空余部位封闭，探针就会被结合，掩盖了特异性杂交。 常用的封闭剂有两类，一类是变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA等。另一类是高分子化合物，如聚蔗糖400(菲可)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、小牛血清白蛋白(BSA)，这三种试剂按一定比例配比，就构成Denhardt’s封闭试剂。此外，脱脂奶粉也可使用，还有使