动物细胞工程课件.pptxVIP

;动物细胞培养是动物细胞工程的一项基本技术，它是细胞融合、细胞拆合、细胞凋亡、染色体导入和基因转移等项研究的技术基础，同时体外培养细胞也是医学研究尤其是肿瘤学研究的极其重要的材料。;原代培养：由体内直接取出组织或细胞进行培养。 原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。 最常用的原代培养方法有组织块培养和分散细胞培养。 继代培养（传代培养）：将原代细胞分散后继续在培养基中进行培养。;;一、动物细胞原代培养的启动;;对动物细胞原代培养的关键主要集中在培养组织的选择、培养基的选择与优化、培养条件的优化、添加物（包括营养成分与生长因子等）的筛选，以及细胞的转化技术等几个方面。;（一）最适培养组织的筛选 ;（二）最佳培养基的选择与优化 ;1. 基本培养基的选择;2. 培养用血清的选择;动物细胞培养中，为了模仿体内环境条件，利于细胞代谢生长，细胞培养液中通常要加入5-15％的动物或人的血清，由于血清来源有限、价格高、且血清成分复杂难测，每一批血清的成分都有可能不同，这使大量细胞培养受到了限制，培养条件也难以保持完全一致。 因此近年来又出现了一种新的细胞培养方法——无血清培养，即在基础培养基中添加各种促细胞生长因子、激素等，取代血清，以使培养基成分更加明确。;3.其它补充营养成分的选择 ;在正常培养条件下，细胞的生长、增殖、分裂与代谢需要添加适量的生长因子。 根据目前的研究结果，能促进动物细胞生长和分裂的有EGF、bFGF、TGF-?、IGF 、PDGF、NGF…… ;1. 培养液的pH值;贴壁细胞所覆盖的培养容器表面积的百分比与细胞外形是评价细胞培养成功与否的重要指标。 ;一、动物细胞原代培养的启动;二、动物细胞系的建立技术;建立细胞系的关键就是要千方百计地使培养细胞发生转化，即用某种因子刺激正常细胞发生突变而具有癌性。;（一）物理因子;（二）化学因子;（三）生物因子;Rous肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)：一种RNA病毒，其基因组中含有一个癌基因src，其编码产物为具有蛋白质激酶活性的pp60src蛋白，可使许多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞癌变。 pp60src蛋白是一种膜蛋白，结合在质膜的内表面，它可催化磷酸根转移到一些蛋白质的Tyr残基上，使磷酸化Tyr在细胞中的含量提高了10倍。;Rous肉瘤病毒(Rous sarcoma virus);;SV40（simian vacuolating virus 40）;虽然动物细胞在培养皿、培养瓶、培养板中均可生长，但在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。 目前这一问题已经解决，人们在微生物培养用的发酵罐的基础上研制出一种用于哺乳动物细胞培养的反应罐，用以大量培养悬浮细胞（1个振动搅拌器：可以使细胞得到充足的营养和氧气）。;一、动物细胞原代培养的启动;细胞分裂的同步化，对研究细胞周期和染色体标本制作等是非常有用的。;细胞周期同步化的方法大致可分为3大类： ;这一类方法是把处于同一周期阶段的细胞挑选出来，加以集中。 最简单的方法是用微吸管在显微镜下手工挑选中期细胞。如果用专门的电子装置挑选，每秒钟可挑出1000个细胞。 但要快速取得大量同步细胞，则要使用其它方法如过滤、蔗糖梯度离心和膜淘洗等。;1. 过滤：将细胞培养物用多层滤膜过滤，小细胞首先通过，集中起来进行同步分裂。此法常用于微生物的分选。 2. 蔗糖梯度离心：混合细胞悬液经密度梯度离心后，小细胞集中在蔗糖梯度的顶部，搜集起来便可进行同步培养。酵母和哺乳动物细胞培养物可用此法同步化分选。 3. 膜淘洗：把细胞培养物先结合到滤膜上，再用温热的培养液连续缓慢流经倒置滤膜，新形成的子细胞被冲洗下来，将在短时间内冲洗下来的细胞集中则成为高度同步的细胞。如果滤膜够大，即可得到大量同步化细胞。 ;一种办法是将培养液中减少某种细胞必需的营养成分，过一段时间后再把该成分加进去，以达到同步化的目的。;1. 温度——细胞同步化的有效手段 由于分裂前细胞中的一些酶对温度非常敏感，高温可使分裂停止, 而生物合成继续进行，因此有些细胞发生分裂的时间推迟，其它后进的细胞便趁此赶上来，达到同步化状态。 Zeutnen和Scherbaum(1954年)发现，将四膜虫(Tetrahymena)在29.5℃(最适温度)与34℃(抑制温度)两种温度下每30min进行交替培养，经7次循环之后，再于24℃下培养，结果有85%的细胞发生了同步分裂。;2. 辐射——引起细胞同步分裂的方法之一 分裂前的细胞对射线很敏感，辐射可使细胞在分裂前积累, 随后去除辐射，细胞便在同一时间开始分裂。 3. 有丝分裂抖落法——哺