化学分离工程课件-变性与复性.pptVIP

稀释复性法 精氨酸浓度对蛋白质复性的影响 稀释复性法 盐酸胍浓度对复性的影响 稀释复性法 不同蛋白质因其结构和变性条件及程度的差异，复性条件和影响因素不同，结果也不同。 研究控制复性条件和因素的目的是最大限度抑制聚集反应，促进正确折叠反应，达到最大的复性率。 伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多个分子之间的反应，在动力学上属于二级以上的反应，而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装过程，动力学多属于一级反应。 两者相比，聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。在低浓度进行复性有利于控制聚集反应。 稀释复性法 通常，复性的蛋白质浓度为10~50μg/mL。 存在蛋白质浓度低复性率高，蛋白质浓度高复性率低的矛盾。 操作方式 一次性稀释：操作方式，速度 分段稀释：一般采用两步法，先将变性剂浓 度降低到一中间浓度，最后再完全除去。 连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液按一定 比例连续混合，复性。 分段和连续稀释法的复性回收率高于一次性稀释。 稀释复性法 分段稀释复性时时间间隔对复性率的影响 稀释复性法 简单稀释和分段稀释复性比较 稀释复性法 稀释复性应用于大规模生产的问题： 复性缓冲液量大，体积大，设备利用率低； 蛋白质浓度低，产物回收困难； 稀释复性法是其他复性法的基础。对一个新的包涵体蛋白质复性时，首选的方法是稀释复性法。从中获得的条件和认知可供其它方法参考。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。 最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为： 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， 降低错误折叠蛋白质的稳定性， 增加折叠复性中间体的溶解度， 增加非折叠蛋白质的溶解度， 减少复性中间体接触发生聚集反应。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 聚集反应抑制剂的种类： 可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。 对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。 Zn2+ 和Cu2+可稳定折叠中间体。 浓度为0.5~1.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。 在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。 认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如 Chaps、Triton X-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。 使用它们的不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。 多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子I的复性，除了在复性液中加入Cu2+和Mg2+、2mol尿素、盐类（1mol/L NaCl、DTT）外，还加入乙醇、甘油等。 单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。 人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。 蛋白质复性时聚集反应的抑制 常用的蛋白质复性添加剂 复性添加剂 复性蛋白质