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PCR常见问题之二 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 非特异性扩增 第九十三页，共一百四十页，2022年，8月28日 PCR常见问题之三 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2 第九十四页，共一百四十页，2022年，8月28日 PCR常见问题之三 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 第九十五页，共一百四十页，2022年，8月28日 PCR常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 第九十六页，共一百四十页，2022年，8月28日 PCR常见问题之五 引物二聚体 第九十七页，共一百四十页，2022年，8月28日 5. 分子检测的靶标基因 第九十八页，共一百四十页，2022年，8月28日 Purvis and Hector, 2000, Nature 昆虫 菌物 昆虫和菌物的物种丰富度 第九十九页，共一百四十页，2022年，8月28日 The mitochondrial cytochrome oxidase c subunit I (COI) gene is one of the most popular markers for population genetic and phylogeographic studies across the animal kingdom. 第一百页，共一百四十页，2022年，8月28日 5` 3` LCOF 1490* Ag1718F° 1401 2942 COI tRNA Coding Regions Gene Coding Regions Control Region Barcoding Region Forward Primer Reverse Primer HCOR 2198* Ag1859R° mtDNA Genome The order of genes on the mitochondrial genome 第一百零一页，共一百四十页，2022年，8月28日 Relatively well studied at the biochemical level Size and structure conserved across all aerobic organisms Mix of variable and conserved regions Largest of the three CO subunits Broad spectrum of substitutional rates 第一百零二页，共一百四十页，2022年，8月28日 菌物常用的靶标基因 第一百零三页，共一百四十页，2022年，8月28日 第一百零四页，共一百四十页，2022年，8月28日 核糖体基因包括5S、5.8S、18S、28S在内的4个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列。 编码18S、5. 8S和28S的rDNA作为1个转录单 元，以中等重复的串联形式存在于染色体 上。 第一百零五页，共一百四十页，2022年，8月28日 18S (SSU) 5.8S 28S (LSU) IGS ITS 1 ITS 2 IGS 5’ 3’ IGS，基因间隔区（ intergenic region spacer）； ITS，内转录间隔区（ internal transcribed spacer） ITS5 ITS1 ITS3 ITS2 ITS4 ITS4-B rDNA （核糖体DNA）基因的结构图 第一百零六页，共一百四十页，2022年，8月28日 ITS作为DNA条形码的优点 （1）ITS两侧序列保守便于设计通用引物，可广泛应用于 PCR 扩增； （2）ITS的高重复度有利于从微量DNA 样品中进行检测 （3）ITS可应用于同属近缘种及种内的进化关系研究； 第一百零七页，共一百四十页，2022年，8月2