核酸分子杂交与应用.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第六十三页，共八十五页，2022年，8月28日 第六十四页，共八十五页，2022年，8月28日 Southern 印迹杂交过程 1、DNA样品的酶切和电泳 2、电泳胶的处理 3、DNA的转移 4、DNA的固定 5、DNA膜的杂交 第六十五页，共八十五页，2022年，8月28日 杂交过程 1、预杂交：为了减少非特异性杂交反应，在杂交前应进行预杂交，将非特异性DNA位点封闭。常用的封闭物有两类：其一是变性的非特异性DNA，大多采用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封闭DNA上的非特异位点；封闭膜上与非特异性DNA结合位点。 第六十六页，共八十五页，2022年，8月28日 预杂交液的配制 6×SSC（1×SSC为0.15mol/L NaCl和 o.o15mol/L柠檬酸） 5×Denhardt’s溶液 0.5％SDS 100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA 50％甲酰胺(可不用) 50×Denhardt： 聚蔗糖(Ficoll 400) 5g 聚乙烯吡咯烷酮 5g 牛血清白蛋白(组分V) 5g 加水至500ml，分装后保存于－20oC 第六十七页，共八十五页，2022年，8月28日 10mg/ml鲑鱼精DNA：超声法或用注射器通过6号针头反复抽打将DNA打断。煮沸后置－20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分钟后速置冰浴中。 甲酰胺：使用前用Dowex XG8混合床阴阳离子交换树脂处理1小时，小量分装后置－70oC保存。 第六十八页，共八十五页，2022年，8月28日 膜的处理：将结合了DNA(或RNA)的硝酸纤维素膜或尼龙膜浸泡于6×SSC溶液中2分钟，使其充分湿润。 预杂交：将湿润的滤膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入预杂交液，尽量排除其中的气泡后用封口机封口。 第六十九页，共八十五页，2022年，8月28日 温育：将杂交袋浸入适当温度的恒温水浴中(不加甲酰胺时用68oC；加入50％甲酰胺时，恒温42oC)，温育1～2小时，也可延长至12～16小时。保温过程中应不断摇动塑料袋，以赶走盖在滤膜表面的气泡，否则这些气泡将阻碍杂交液与滤膜的接触。(如果将预杂交液加热到适当温度后再加入塑料袋内，可以减少气泡产生)。 第七十页，共八十五页，2022年，8月28日 2、杂交：杂交反应是单链核酸探针与待测核酸分子中的特异基因序列在一定的温度下杂交复性的过程。杂交包括以下过程： 1、杂交液配制：同预杂交液 2、探针变性：放射性标记的探针为双链时，于100oC加热5分钟变性并迅速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性 第七十一页，共八十五页，2022年，8月28日 3、打开预杂交袋弃去预杂交液，加入杂交液及变性的探针。排除气泡后重新封好口 4、在与预杂交相同温度下，保温8～16小时 第七十二页，共八十五页，2022年，8月28日 洗膜：是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去的过程，非特异性杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定温度下，非特异性杂交体解链而被洗掉，而特异性杂交体则保留在滤膜上。杂交体的解链温度主要取决于杂交体的同源性和溶液的离子强度两个要素，同源性越高离子强度越高，杂交体的稳定性越高。 第七十三页，共八十五页，2022年，8月28日 洗膜的操作如下： 1、杂交完毕，取出杂交袋，剪去一角，弃去所有的杂交液，取出膜并迅速浸泡于大量2×SSC和0.5% SDS溶液中，室温下不断振荡。注意不要使滤膜干燥。 2、5分钟后，将滤膜转移至一盛有大量2×SSC和0.1% SDS溶液的容器中，室温振荡15分钟。 第七十四页，共八十五页，2022年，8月28日 3、将滤膜转移至一盛有大量0.1×SSC和0.1% SDS溶液的容器中，37oC振荡漂洗30分钟至1小时。 4、将滤膜转移至一盛有大量0.1×SSC和0.1% SDS溶液的容器中，65oC振荡漂洗30分钟至1小时。直到用盖革计数器在无DNA区域检测不出放射信号为止。 5、室温下，滤膜用0.1×SSC稍稍漂洗。然后置滤纸上吸去溶液，置－70oC放射自显影。 第七十五页，共八十五页，2022年，8月28日 杂交液组成： 50％甲酰胺 5xSSC 1xFPG 25mmol/L磷酸缓