利用生物工程法制备重组胰岛素.pptVIP

胰岛素类似物BKRA 构建与表达 2005级生命科学基地班 杜鹃 苗春晖 李嫄 王立军 第一页，共二十三页。 1、胰岛素的结构 胰岛素是一条多肽，分子质量5734，由51个氨基酸组成。它含有A、B两条链，A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成，它们之间有两条二硫键A7-B6、A20-B19。此外，A链自身在6 与11位有第三条二硫键 第二页，共二十三页。 第三页，共二十三页。 2.用基因工程方法生产人胰岛素主要途径 一种是胰岛素原途径，即基因工程所生产的是胰岛素原或是其类似物，然后将胰岛素原或者其类似物体外转化为胰岛素。 另一种是A，B链重组途径，即用基因工程方法分别产生胰岛素A，B链，纯化的A，B链再经重组产生胰岛素。 第四页，共二十三页。 人胰岛素原类似物BKRA基因的合成 将BKRA基因分成6个片段合成，其中F1、F3、F5片段为正向链，F2、F4、F6片段为反向链（Fig.1）。将各基因片段按等摩尔数混合、退火：以Klenow片段完成中间补链和末端补平，获得含有限制性酶切位点的BKRA基因片段，全长 182bp。 第五页，共二十三页。 BKRA片段基因结构 GGG AAT TCT ATG TTC GTT AAC CAG CAC CTG TGT GGC TCT CAC CCC TTA AGA TAC AAG CAA TTG GTC GTG GAC ACA CCG AGA CTG CTC GTA GAA GCT CTG TAC CTG GTT TGC GGT GAA CGT GGC TTC GAG CAT CTT CGA GAC ATG GAC CAA ACG CCA CTT GCA CCG AAG TTT TAC ACT CCG AAA ACT AAG CGC GGT ATC GTT GAA CAG TGT AAA ATG TGA GGC TTT TGA TTC GCG CCA TAG CAA CTT GTC ACA TGC ACC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT ACG TGG AGG TAG ACG AGG GAA ATG GTC GAC CTC TTG ATG ACA AAC TGA AGC TTG GG TTG ACT TCG AAC CC EcoRI 小C肽 PvuII HindIII F1 F2 F3 F4 F5 F6 M K R 终止 B肽 A肽 第六页，共二十三页。 人胰岛素原类似物BKRA基因的克隆 分别以EcoRⅠ- HindⅢ双酶切pUC18 DNA和上述构建的BKRA基因片段（182bp），将载体DNA与BKRA片段（171bp）连接，获得重组质粒pUCⅠ。分别经EcoRⅠ-HindⅢ双酶切和PvuⅡ不完全酶切鉴定，均产生了与 其大小的DNA片段。 第七页，共二十三页。 串联BKRA基因的构建 为了正确连接两个BKRA基因，在此设计了一个连接头接在前一个BKRA基因的末端，并构建了一个能与下一个BKRA基因5’端EcoRI粘端互补的序列。 然而由于接头是在PvuII平末端与前一个BKRA基因连接的，因此会切掉部分胰岛素A链基因，所以接头要补上相应的部分。 第八页，共二十三页。 串联BKRA基因的构建 为进行，合成了彼此互补的两个片段： 然后将磷酸化的F7与等摩尔的F8退火，中间接头形成： F7：CTG GAG AAC TAC TGT AAC CGT CGC 正向链 F8：AAT TGC GAC GGT TAC AGT AGT TCT CCA G 反向链 -CTG GAG AAC TAC TGT AAC CGT CGC- -GAC CTC TTG ATG ACA TTG GCA GCG TTA A- 5’ 3’ 接头基因对比 PvuII位点 EcoRI位点 第九页，共二十三页。 TGC ACC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT ACG TGG AGG TAG ACG AGG GAA ATG GTC GAC CTC TTG ATG ACA AAC TGA AGC TTG GG TTG ACT TCG AAC CC TGC ACC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT ACG TGG AGG TAG ACG AGG GAA ATG GTC GAC CTC TTG ATG ACA AAC CGT CGC AAT TCT ATG TTC GTT…… TTG GCA GC