超级干货！PCR、等温扩增、测序，分子诊断技术全解析！（建议收藏）.docxVIP

PAGE2 / NUMPAGES2 超级干货！PCR、等温扩增、测序，分子诊断技术全解析！（建议收藏） 近年来，随着分子诊断技术的升级迭代，分子诊断的临床应用越来越广泛和深入，分子诊断市场进入快速发展期。 笔者总结市场上常见的分子诊断技术，分为上中下三篇，上篇介绍PCR技术，中篇介绍核酸等温扩增技术，下篇介绍测序技术。 01 上篇：PCR技术 PCR技术 PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，是体外DNA扩增技术之一，至今已经超过30年的历史。 PCR技术于1983年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，1985?年Mullis申请了PCR专利，同年在Science上发表了第一篇PCR?学术论文，1993?年Mullis因此获得了诺贝尔化学奖。 PCR基本原理 PCR可以将目标DNA片段扩增一百万倍以上，其原理是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 标准?PCR?过程分为三步： 1.变性（Denaturation）：利用高温使DNA?双链分离。DNA双链之间的氢键在高温下（93- 98℃）被打断。 2.退火（Annealing）：在?DNA?双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA?上。 3.延伸（Extension）：DNA?聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着DNA?链合成互补链，延伸完成，则完成一轮循环，DNA片段数增加一倍。 往复循环这三个步骤25-35?次，DNA?片段数将得到指数级增加。 PCR的巧妙之处在于针对不同的目标基因可以设计不同的引物，使目标基因片段在短时间内得到百万级的放大。 目前为止，PCR可以分为三类，分别是普通PCR、荧光定量PCR和数字PCR。 第一代普通PCR 采用普通PCR?扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，只能做定性分析。 第一代PCR主要缺点： 容易发生非特异性扩增和假阳性结果。 检测耗时长，操作繁琐。 只能做定性检测。 第二代荧光定量PCR 荧光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累，通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq?值和标准曲线来定量。 ? qPCR?技术由于操作过程在封闭体系中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为PCR中的主导技术。 实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为：TaqMan荧光探针、分子信标和荧光染料。 ? 1)TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 ? 2)SYBR荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。 3)分子信标 是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。 PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。 ? 第二代PCR主要缺点： 灵敏度还有欠缺，低拷贝标本检测不准确。 存在背景值影响，结果易受干扰。 当反应体系中有PCR抑制物时，检测结果易受干扰。 ? 第三代数字PCR 数字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通过终点检测计算目标序列的拷贝数，无需采用内参和标准曲线即可进行精确的绝对定量检测。 数字PCR采用终点检测，不依赖于Ct值（循环阈值），所以数字PCR反应受扩增效率的影响降低，对PCR反应抑制物的耐受能力提高，具有很高的准确度和重现性。 由于具备高灵敏度、高精确度的特点，不易被PCR反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，而成为研究和应用热点。 根据反应单元的不同形式，主要可分为微流体式、芯片式和微滴式三大类系统。 1)微流体数字PCR，Microfluidic digital