普通PCR、荧光PCR、数字PCR；优缺点解析！.docxVIP

PAGE2 / NUMPAGES2 普通PCR、荧光PCR、数字PCR；优缺点解析！ 我心目中检测技术史上的几次革命性发明分别是基于抗原抗体特异性结合原理的免疫标记技术，PCR技术和测序技术。今天我们来聊聊PCR技术，按照PCR技术的演进，人们习惯性的将PCR技术划分为三代：普通PCR技术，实时荧光定量PCR技术和数字PCR技术。 一、普通PCR技术 KARY MULLIS?（1944.12.28-2019.8.7） Kary Mullis于1983年发明了聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction?，PCR），据说是载着女友开车的时候，忽然灵光一闪，想到了PCR原理（论开车的好处）。Kary Mullis于1993 年获诺贝尔化学奖。《纽约时报》如此评价： 具有高度原创性和重大意义，几乎将生物学分为 PCR 前和 PCR 后两个时代。 PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 (图片来网络，版权归原作者所有) 普通PCR的优点 经典方法，国际和国内标准齐全 仪器试剂成本较低 PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验 普通PCR的缺点 容易污染 操作繁琐 只能定性分析 敏感性中等 存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分 基于毛细管电泳的PCR 针对普通PCR的缺点，一些厂家推出了基于毛细管电泳原理的仪器，将PCR扩增后电泳的步骤在毛细管中完成，灵敏度更高，可以区分几个碱基的差异并且通过MAERKER可以计算出扩增产物的含量。缺陷是仍然需要将PCR产物打开后放入仪器，仍然存在很大的污染风险。 毛细管电泳图 二、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time?PCR ，qPCR）技术?荧光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。荧光定量PCR的发展史是一部ABI、罗氏和伯乐等巨头的荡气回肠的斗争史，感兴趣的可以去查查。该技术是目前最成熟，使用最广泛的半定量PCR技术。 荧光染料法（SYBR Green I）：?SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。由于染料是与双链DNA的非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。 荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5 － 3 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。临床检测中Taqman探针法是最常用的检测方法。 (图片来网络，版权归原作者所有) qPCR的优点 方法成熟，配套仪器试剂齐全 试剂成本中等 操作简单 检测敏感性高，特异性高 qPCR的缺点??1.目的基因发生突变导致漏检? 2.低浓度模板检测结果无法确定? 3.使用标准曲线进行定量检测时误差较大。 三、数字PCR（digital?PCR ，dPCR）技术 ?数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接读出DNA/RNA分子的个数，是对起始样品核酸分子的绝对定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。 2006年，Fluidigm公司第一个生产商业化的基于芯片的dPCR仪。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系统，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系统，采用高密度的纳升级微流控芯片技术，将样本均匀的分配至20 000个单独的反应孔中。 ? ? ???(图片来网络，版权归原作者所有)? ? ? 2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100 dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20 000个微滴油包水中，利用微滴分