《基础毒理学》课件-毒理学实验基础.pptVIP

* * 1. 细胞的一般形态：每天或最多l ~ 2 d对细胞形态用倒置（相差）显微镜进行观察，生长良好的细胞透明度大、折光性强、轮廓不清。 2. 细胞骨架：用细胞骨架特异性免疫抗体进行免疫组化染色，观察微丝、微管和中间纤维的变化。 * * 3. 细胞生长的观察 (1) 生长曲线 (2) 细胞分裂指数 (3) 细胞周期 * * 4. 细胞活力的测定 (1) 染料排除法：当细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透变性的细胞膜与解体的DNA结合使其着色，而活细胞则能阻止这类染料进入细胞内，据此可鉴别死细胞与活细胞。 * * 台盼蓝排斥试验：将培养细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为106个/mL，取该细胞悬液0.lmL加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，3min内用血球计数板分别计数活细胞数和死细胞数，在光镜下死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。 * * (2) 四唑盐(MTT)比色法：显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的染料，其化学名：3-4, 5-二甲基噻唑-2, 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝，简称MTT。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。 * * (2) 四唑盐(MTT)比色法：二甲基亚砜(DMSO) 能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内MTT结晶物形成的数量与细胞数成正比。 该法特点是灵敏度高、重复性好、操作简便。 * * (3) 克隆形成率：是检测培养细胞能否增殖的过硬指标之一，细胞制成悬液后，以低密度(2~5个细胞/cm2 ) 接种，这样单个细胞能持续增殖6代以上，形成细胞小群(克隆) 的细胞百分数称为克隆形成率，表示细胞群的活力。其细胞接种的存活率与细胞活力成正比。 * * （二）细胞染色体分析 在有丝分裂中期，染色体长短、大小、着丝点等特征较为典型，容易观察。 染色体分析技术： 染色体分带 姐妹染色单体分化染色 染色体原位杂交 染色体荧光基因标记法等 * * 1. 染色体显示 核型分析：即分析各种细胞的染色体数目，大小及形态特征。 一种蝉（Platypleura kaempferi）的有丝分裂核型 * * 2. 染色体结构分析 （1）染色体畸变检测 （2）微核检测 （3）染色体显带技术 （4）姐妹染色单体差别染色（SCE) （5）高分辨染色技术 （6）染色体原位杂交技术(FISH) * * 染色体原位杂交技术(FISH技术) 用荧光标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的D N A或R N A序列。 用于标记探针的半抗原报告分子多采用生物素或地高辛，然后分别与它们有特异性高亲和力的抗生物素和抗地高辛抗体结合，再在配体上分别连接不同的荧光物质，如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等。最后在荧光显微镜下观察杂交信号。 * * 细胞培养的类型 （1）原代细胞培养 （2）传代细胞培养。 * * 1．原代细胞培养 原代细胞培养，是从供体取得组织细胞后，在体外进行的首次培养。 此期细胞活跃，可见细胞分裂，但不旺盛。一般维持l～4周。 * * 原代细胞特点 生物学特性、形态结构和功能与体内原组织相似。 细胞相互依赖性强，独立生存能力差。 具有二倍体遗传性，最接近和反映体内特征 * * 原代细胞培养方法 组织块法 消化法。 * * (1) 组织块培养法：常用、简便易行、成功率高。 将组织块剪切成小块后，接种于培养器皿表面。其器皿表面可根据不同细胞生长的需要做适当处理，如预先涂上一层胶原(鼠尾胶等) 以利于上皮细胞生长 * * (2) 消化培养法是将组织通过消化酶(如胰酶、蛋白酶、EDTA、胶原酶等) 作用进行消化分离，把妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等除掉，使细胞分散成单个细胞悬液，接种到培养皿中贴附生长。 * * 优点：使细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。适用于培养大量组织原代细胞。 缺点：步骤繁琐，易污染，一些消化酶价格昂贵，成本高。 * * 2．传代细胞培养 原代细胞经培养不断增殖，原代培养细胞相互汇合后，需要进行分离培养，否则会影响细胞生长。 细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程，称之为传代。 * * 首次传代注意点： ①细胞生长汇合没到一定程度(覆盖瓶底壁约80%)不要急于传代； ②原代培养时细胞多为混杂生长，特别是上皮细胞和成纤维细胞并存的情况较为多见。此时可根据不同细胞对消化酶具有不同的耐受时间来进行分离和纯化； * * 首次传代注意点： ③经消化的细胞在分散吹打时动作要轻巧，尽可能减少对细胞的损伤； ④首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞的生存和增殖。 * *