荧光定量PCR中探针法与染料法的区别(1).pdfVIP

荧光定量PCR 中探针法与染料法的区别： 一、荧光定量PCR 中探针法与染料法的描述： 1.荧光定量PCR 探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的 两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当 DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远， 发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量 2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR 扩增的 时候，染料结合到 DNA 上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信 号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA 都回结合发光。 二、荧光定量PCR 中探针法与染料法的优缺点 1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段 上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行 反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高 2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR 产物的TM 值，缺点 就是特异性没有探针法好 【分享】定量pcr 仪选则宝典:各自精彩的选择 如何选择合适的定量 PCR 仪定量PCR 仪主要由两部分组成，一个是PCR 系 统，一个是荧光检测系统。选择定量 PCR 仪的关键——由于定量 PCR 必需借助 样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR 系统来说，重要的参数除 了传统PCR 的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一 性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当 今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用 范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测 单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。 荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光 器、发光二极管LED 光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光 二极管LED 价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED 才能更 好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD 成像系统和PMT 光电倍增管， 前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐 个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR 仪需要考 虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件 可以满足常规使用。——随着定量PCR 技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、 肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR 仪也不 断推陈出新，生物通在这里着重介绍不同的3 类定量PCR 仪，各有各精彩。 1. 传统的96 孔板式定量PCR 仪传统的96 孔板式定量PCR 仪以美国应用生 物系统公司(ABI)为代表。传统96 孔板式定量PCR 仪的优点是可容纳的样本量大 而且无需特殊耗材，可以采用传统的96 孔板甚至384 孔板进行批量的定量反应， 但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的 PCR 温度控 制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效 应，因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温 度控制也可能存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR 来说，任何极微小的差异都 会以指数级别的规模被放大，不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大，温度控 制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。96 孔板定量 PCR 仪的荧光检测分析系统，由于96 孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距 离光源和监测器的光程各不相同，有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行， 试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ 和Bio-Red 公司的定量 PCR 仪也属于这一类。ABI 的7500 型荧光定量PCR 仪激发光源为卤钨灯光源，5 色滤光镜，可同时激发 96 个样品，超低温 CCD 具备同时多点多色检测的能力， 能够有效地分辨 FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和 Cy5 等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP 分析、基因型分型和带阳 性内对照的阴