《生化分离技术》3.5 电泳技术.pptVIP

离子强度的选择 离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。 一般选择缓冲液的离子强度为0.01-0.1 mol/L之间 凝胶浓度的选择 由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为： 非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 -1.0%的琼脂糖凝胶； 排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 三大效应： 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 8.3 样品 蛋白质 6.7 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.7 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.9 小 有效迁移率 = 迁移率 ? 解离度 （1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。 （2）凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。 浓缩效应 操作步骤： 1.制备PAGE胶柱 封口 灌分离胶，封水 灌浓缩胶，封水 2.上样，电泳 3. 染色，观察结果 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定； 特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。 蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变 未知蛋白质分子量的测定 基于上述SDS的原理介绍，我们可以利用SDS电泳进行未知蛋白质的分子量测定； 以不同分子量的标准蛋白进行SDS电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量； 标准蛋白分子量 未知蛋白 在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。 相对迁移率 水平式电泳装置 电泳缓冲液 凝胶 任务二 新型辅助提取技术 一、超声辅助提取技术 超声波（supersonic wave 或ultrasonic wave）： 频率高于20kHz，人的听觉阈以外的声波。 是中药提取新技术 近年用于中药制剂质量控制如: 1995年版《中国药典》：收载超声提取的中药品种117种 2000年版《中国药典》：收载超声提取的中药品种232种 2005年版《中国药典》：404种,用于含量测定304种 超声波提取（supersonic wave extraction SWE ） ： 利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大溶剂（介质）分子的运动速度，增大溶剂的穿透力，提取中药中有效成分的方法。 声波：能使正常人听觉器官产生声音感觉的机械波。 频率范围：10-20kHz。 频率20kHz???? 超声波 1.不需高温，节省能源，热敏成分不破坏。 2. 提取效率提高，药材资源不浪费 3. 省溶剂。 4. 物理变化，成分活性不受影响。 5. 时间短，省时，杂质少，成分含量高 （一）超声提取（SWE）的特点 （二）超声提取分离技术的原理 1 机械效应：SW在溶剂中的传播使介质质点沿着一定方向振动，强化介质的扩散、传质。 SW产生的辐射压强→使物料细胞变形、破裂、蛋白变性。 SW给予溶剂、悬浮体的加速度，使得两者产生摩擦力↑， 使分子解聚 ，有效成分溶解。 2.化学效应：超声波的作用可促使发生或加速某些化学反应。各种氨基酸和其他有机物质的水溶液经超声处理后，特征吸收光谱带消失而呈均匀的一般吸收，这表明空化作用使分子结构发生了改变。 3 空化效应： 溶剂中溶解的气泡→在SW振动→气泡定向扩散变大↑→产生共振腔→突然闭合，湮灭，即空化效应。产生很高压力↑→细胞壁瞬间破裂，利于成分溶出。在湮灭过程中有放电、发光现象，可用于清洗、乳化、促进化学反应等。 4 热效应： SW在溶剂中传播是能量传递过程，声能被介质吸收转化成热能，导致介质和药材组织升温，加快成分