《生化分离技术》4.2 青霉素的制备及测定.pptVIP

【实训目的】 1熟练掌握絮凝技术、固液分离技术、萃取技术、吸附技术、结晶技术和干燥技术等生化分离技术的操作方法； 2..掌握以发酵液为原料，生产生物产品的一般工艺流程； 3.具备参考《中国药典》中检验方法，HPLC法测定样品含量的能力。 青霉素盐如青霉素钾或钠盐为白色结晶性粉末，无臭或微有特异性臭，有引湿性。干燥品性质稳定，可在室温保存数年而不失效，且耐热。遇酸、碱、重金属离子及氧化剂等即迅速失效。极易溶于水，微溶于乙醇，不溶于脂肪油或液状石蜡。其水溶液极不稳定，在室温中效价很快降低10%，水溶液pH为5.5～7.5。? 青霉素是利用特定的丝状或球状菌种，经培养发酵生成。发酵液中青霉素的含量只有4％左右；发酵液中除了含有很低浓度的青霉素外，还含有大量包括菌种本身、未用完的培养基（蛋白质类、糖类、无机盐类、难溶物质等）、微生物的代谢产物及其他物质等杂质。青霉素在水溶液中也不稳定， ? 【实训原理】 青霉素的提取采用溶媒萃取法。 利用抗生素在不同的pH值条件下以不同的化学状态（游离态酸或盐）存在时，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。青霉素分子结构中有一个酸性基团(羧基)，青霉素的pKa=2．75，所以将青霉素G的水溶液酸化至pH2.0左右，青霉素即成游离酸。这种青霉素酸在水中溶解度很小， 但易溶于醇类、 酮类、醚类和酯类，可用溶媒萃取法从发酵液中分离并提纯青霉素。 在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，当pH值在2.0左右时，青霉素酸在乙酸丁相中的溶解度比在水中的溶解度大40倍以上，利于萃取过程的进行。因此，从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH 选择 1.8-2.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH 选择6.8-7.4。 【实训器具与试剂】 1.器具 萃取装置或分液漏斗，板框过滤器或真空转鼓过滤器，活性炭，硅藻土。 2.试剂 青霉素发酵液（或者市售注射用青霉素钾），醋酸丁酯，溴代十五烷吡咯（PPB），乙酸钾，丁醇或乙醇，硫酸，碳酸氢钠。 【实训操作步骤】 1.发酵液的预处理和过滤 （1）冷却发酵液 当发酵完成后，应及时将发酵液冷却至10℃以下。生产中通常采用板式换热器进行冷却。 （2）等电点除杂与凝絮 用10％硫酸调pH至4.5～5.0，使pH在杂蛋白的等电点附近。加0.07％的溴代十五烷吡咯（PPB）进行预处理。 （3）固液分离。发酵液中加入0.7%硅藻土作助滤剂，用板框过滤或转鼓真空过滤，也可采用超滤分离技术来分离青霉素发酵液，除去菌丝。 2．溶剂萃取 （1）萃取 一次有机相提取。用10％硫酸将滤液的pH值调低至1.8~2.2，用滤液1/3体积的乙酸丁酯萃取，5℃，进行一次醋酸丁酯萃取分离。 一次水相提取。萃取相（醋酸丁酯相）经水洗（洗去相中的水溶性杂质）后，按照1:5（体积比）用1.5%碳酸氢钠溶液（pH6.8-7.4），5℃萃取。 二次有机相相萃取。用10％硫酸将的碳酸氢钠溶液萃取相的pH值再调低至1.8~2.2，加入醋酸丁酯及适量破乳剂，5℃萃取。 3.脱色 每升萃取液中添加150~250g活性炭，搅拌15~20min,除去色素、热源，过滤，除去活性炭。 4.结晶 在脱色后萃取相中加入25%乙酸钾丁醇溶液（也可是乙酸钾乙醇溶液），真空度大于0.095MPa，温度45~48℃共沸蒸馏结晶，水和丁醇形成共沸物蒸出，青霉素钾盐结晶析出。为进一步提高青霉素的纯度，可对晶体进行重结晶。晶体经过洗涤，干燥后，得到精制青霉素产品。 5.青霉素钾含量测定 《中国药典》收载的青霉素钾含量测定方法为HPLC法，试验条件同青霉素钠项下：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值为2.5）-乙腈（70：30）为流动相；检测波长为225nm；流速为每分钟1ml。 [注意事项] 1.醋酸丁酯易燃。急性毒性较小，但对眼鼻有较强的刺激性，而且在高浓度下会引起麻醉，请在通风状态良好的实训室完成实训。 2.为保证实训效果和降低前期准备实训所需工作量，可购置市售青霉素钾粉针，溶于水后用于模拟青霉素发酵液。 【实训结果与处理】 1.如原料为发酵液，用HPLC法测定发酵液中青霉素含量。实训完成后测定精制青霉素晶体的纯度和量。 2.如原料为注射用青霉素钾，称重法测定和计算青霉素含量。实训完成后测定精制青霉素晶体的纯度和量。计算回收率。 【思考与讨论】 青霉素不稳定，请结合实训过程，简述进行分离纯化青霉素的单元操作时，分别都采取了哪些措施，以保证青霉素免于破坏。 * * *