生物化学实验指导：正交法测酶.pptxVIP

延时文字食品与生物工程学院2019级食工、食质、生工、酿酒专业生物化学实验选课课号：2020-2021-1-…… 正交法测定几种因素对酶活力的影响生物化学实验　 CONTENTS 目验目的实验原理实验材料、仪器和试剂操作步骤 PART 01实验目的（1）初步掌握正交法（正交试验设计法）的使用（2）运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH这四种因素对酶活力的影响 PART 02酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活力测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法（简称正交法）来完成。正交法是借助于正交表，简化表格计算，正确分析结果，找到试验的最佳条件、分清因素的主次，这样就可以通过比较少的试验次数达到好的试验效果。本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH时酶的活力最大。实验原理 PART 03实验材料、仪器和试剂1.实验材料牛血清白蛋白、牛胰蛋白2.实验仪器试管及试管架，恒温水浴锅，小漏斗及滤纸，分光光度计，移液管，pH计 （1）牛血清白蛋白（2）蛋白酶液（3）15%三氯乙酸溶液（4）1mol/L pH7、8、9巴比妥缓冲液（5）Folin酚试剂① Folin-酚甲试剂：现配现用② Folin-酚乙试剂（6）0.1mol/L NaH2PO4溶液（7）尿素（8）1mol/L NaOH溶液3.实验试剂 操作步骤PART 041.试验设计2.试验安排3.试验结果及分析 1.试验设计（1）确定试验因素和水平本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH。每个因素选三个水平。实验因素和选用水平如表1所示。表1 试验设计的因素和水平作因素、水平表时，各因素的水平最好不要按大小顺序排列。按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。（2）选择合适的正交表合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度（见表2）。试验号[S]/mL[E]/mL温度/℃pH10.50.850720.20.537930.80.2608 1.试验设计水平1234111112122231333421235223162312731328321393321表2 正交表因素试验号 2.试验安排试验安排设计如表3所示。249168357牛血清白蛋白/mL0.50.20.80.50.20.80.50.20.8缓冲溶液pH9pH8pH7pH7pH9pH8pH8pH7pH92mL2mL2mL1.7mL2.6mL1.7mL2.3mL2.3mL1.4mL37℃预热5min50℃预热5min60℃预热5min酶液/mL0.50.80.20.80.20.50.20.50.837℃反应10min50℃反应10min60℃反应10min试验号试剂表3 试验安排各管均加入15%三氯乙酸溶液2mL终止反应。 2.试验安排另取试管三支作非酶对照，即加2%牛血清蛋白液0.5mL，pH7、8、9缓冲液2.0mL，先加15%三氯乙酸溶液2mL，摇匀放置10min后再加入酶液0.5mL。将上述酶促和非酶对照各管反应液室温放置15min，过滤。滤液保留，用于测定酶活力。酶活力测定：取滤液0.5mL，加入Folin-酚甲试剂4mL，混匀室温放置10min，再加Folin-酚乙试剂0.5mL，迅速混匀，于30℃保温30min后，在680nm处测光吸收值。 试验做好后，把9个数据填入表4的试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除），最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出哪个因素对酶活力影响最大，哪个影响最小，找出在什么条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。3.试验结果及分析 1[S]/mL2[E]/mL3温度/℃4pH试验结果A68011 0.51 0.8501 721 0.52 0.5372 931 0.53 0.23 603 842 0.21 0.8373 852 0.22 0