生物化学实验指导：脂质的提取及薄层层析.pptxVIP

延时文字食品与生物工程学院2019级食工、食质专业 生物化学实验 生物化学实验脂质的提取及薄层层析 CONTENTS 目验目的实验原理实验材料、器材和试剂操作步骤 PART 01实验目的（1）学习移液枪的使用（2）了解薄层层析的原理及操作方法（3）掌握从蛋黄中提取脂类物质的方法，了解其脂类物质的组成成分 PART 02生物组织含有多种脂质成分，包括三酰甘油、胆固醇、脑磷脂和卵磷脂等，它们大多与蛋白质结合成疏松的复合物。要将这类脂质提取出来并与蛋白质分离，所用提取剂必须包含亲水性成分和形成氢键的能力，氯仿-甲醇（2:1，V/V）混合液就是符合要求的生物组织提取剂之一。生物组织脂质提取液，经过多次水洗，弃去含蛋白质的水层，留下溶有脂质的氯仿层，通过硅胶G薄层层析，氯仿层中的脂质成分可被一一分开、检出。实验原理 PART 03实验材料、器材和试剂1.实验材料：煮熟的蛋黄2.实验器材：硅胶板，毛细管点样器，层析缸，移液枪（配枪头），EP管，研钵，10mL针筒，10mL量筒，胶头滴管，试管，铅笔，直尺3.实验试剂： ①脂质提取剂：氯仿-甲醇（2:1，V/V） ②展层剂：氯仿：甲醇：乙酸：水=170:30:20:7（V/V） ③无水硫酸钠 ④碘 操作步骤PART 04点样准备蛋黄脂质的提取点样展层显色12345 1.点样准备（1）作标记取硅胶板一个，在距离板的底边2cm处用铅笔划一条直线，在直线上距侧边1.5cm处作一记号（共两个位点）。再在距离展层起点10cm处用铅笔划一条直线。（2）准备层析缸将展层剂倒入层析缸中，至液面高度约5mm，立即盖上层析缸盖。另取一干洁层析缸，将适量碘粒倒入其中，立即盖上层析缸盖。10cm2cm1.5cm1.5cm 2.蛋黄脂质的提取称取煮熟的蛋黄2g，放于研钵中磨细。另取10mL氯仿-甲醇（2:1，V/V）混合溶剂，一边研磨，一边慢慢加入混合溶剂，在保持均匀的状态下静置10min。将针筒注射器拆开，按针筒直径大小将滤纸剪成小圆片（圆片直径稍大），再将圆片放入针筒底部。在垫好滤纸的针筒中加足够量的无水硫酸钠，并加入氯仿少许润湿。静置后的液体经滤纸过滤到10mL量筒中，记录所得液体的体积，将滤液转移至试管中。于滤液中加入1/2体积的水振摇后静置，于是逐渐分为两层，上层为水层，下层为氯仿层。弃去上层，留下氯仿层，继续水洗三、四次，同样弃去水层。将最后剩下的氯仿层倒入装有无水硫酸钠的针筒内，吸去残留水分，同时用EP管接住从针筒中流出的液体，直至溶液澄清透明。此澄清液即可供脂质薄层层析点样用。 3.点样在硅胶板的两个位点处，分别用点样器吸取上述氯仿层脂质提取液10微升，进行点样。点样直径不要大于3mm，样液分几次点完，等样液干后才能点下一次。4.展层展层在层析缸中进行。将已点了样的硅胶薄板直立在层析缸中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线），盖上层析盖，进行展层。至展层剂前沿到达离起点线10cm处，即可取出硅胶板。用风将硅胶板吹干，驱尽展层剂。 5.显色将风吹干、驱尽展层剂的硅胶薄板，立即放入预先置有碘片数粒的干洁层析缸中，密闭几分钟，已经展层分开的脂质成分将分别吸附碘蒸汽而显现黄色斑点。6.计算测量各脂质斑点的相应距离，计算各种脂质成分的Rf值。 思考题 1.指出各斑点 分别应为何种脂质 2.Rf值的大小受哪些因素的影响？