生物化学实验指导：枯草杆菌蛋白酶活力测定.pptxVIP

枯草杆菌蛋白酶活的力测定实验目的实验原理实验仪器与试剂实验操作步骤 一、实验目的掌握定量测定蛋白酶活力的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性质，以及本反应的环境条件。进一步理解酶活力和比活力的概念巩固比色法测定物质含量的基础，掌握721型分光光度计的原理和使用方法，学习绘制标准曲线的方法。 二、实验原理酶活力概念：指专一性催化某种底物反应的能力，酶活力通常用一定条件下酶催化某种反应的反应速度来表示。枯草杆菌蛋白酶是一种水解酶，它将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。酪氨酸能与酚试剂反应生成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680 nm）用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算枯草杆菌蛋白酶的活力。枯草杆菌蛋白酶活力单位定义：在40 ℃，pH 7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1μg酪氨酸为1U。 三、器材仪器和主要试剂721型分光光度计Folin试剂0.5%酪蛋白溶液500μg/mL酪氨酸溶液蛋白酶液 四、实验操作1、酪氨酸标准曲线的制作管号123456酪氨酸溶液（mL）0.10.20.30.40.50.6水（mL）4.94.84.74.64.54.4稀释后酪氨酸溶液（μg/mL）102030405060Na2CO3溶液（mL）555555酚试剂（mL）111111迅速混合，于30℃显色15minA680nm以酪氨酸浓度μg/mL数为横坐标，A680nm为纵坐标，作出标准曲线。 2、蛋白酶活力的测定管号酶液（mL）酪蛋白（mL）三氯乙酸（mL）30℃水浴准确保温10min三氯乙酸（mL）酪蛋白（mL）30℃水浴保温10min，过滤得滤液1（样品）12----3----2（对照）1----3----2之后分别取3只试管，加入样品滤液、对照滤液和水各1 mL，然后再加入0.55 mol/L碳酸钠溶液5 mL，混匀后加入1 mL酚试剂，并在30℃显色15 min。 3、计算酶活力单位数规定在30℃，pH 7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪蛋白1μg为一个酶活力单位。则1g蛋白酶在37℃，pH 7.5的条件下所具备的总活力单位为：酶活力单位数（U/g）=（A 样—A对）? K ? (V/t) ? N式中 A 样——样品液光吸收值 A对——对照液光吸收值 K——标准曲线上光吸收为1时的酪氨酸质量， μg t ——酶促反应的时间，min，本实验t=10 V ——酶促反应管的总体积，mL，本实验取6 N ——酶液稀释倍数，本实验为1