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生物化学实验食品与生物工程学院2019级生工、酿酒专业延时文字生物化学实验蛋白质的制备及其含量测定目录CONTENTS 01实验目的02实验原理03实验材料、器材和试剂04操作步骤PART 01实验目的（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法（2）掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法（3）学习可见分光光度法测定蛋白质含量的原理和实验技术PART 02实验原理牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛奶的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质，便可分离得到纯净的酪蛋白。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，服从朗伯-比尔定律，利用这一特性，可使用分光光度计测定蛋白质的含量。PART 03实验材料、器材和试剂1.实验材料：新鲜牛奶2.实验器材：离心机，抽滤装置，恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，精密pH试纸，烧杯，温度计，试管及试管架，移液管，滤纸，表面皿3.实验试剂：95%乙醇，无水乙醚，0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液，乙醇-乙醚混合液：乙醇：乙醚=1：1（体积比），1mg/mL酪蛋白母液，Folin-酚试剂（甲、乙液）123PART 04酪蛋白的制备标准曲线制作酪蛋白含量测定操作步骤1.酪蛋白的制备（1）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液100mL，用精密pH试纸调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温，3000r/min离心15min。弃去上清液，得酪蛋白粗制品。（2）酪蛋白的纯化①用蒸馏水洗涤沉淀3次，3000r/min离心10min，弃去上清液。②沉淀中加入30mL95%乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次。最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。③将沉淀摊开在表面皿上，风干，即得酪蛋白纯品。准确称重，计算含量和得率。含量=酪蛋白g/100mL牛奶（%）得率=测得含量/理论含量×100%（式中理论含量为3.5g/100mL牛奶）2.标准曲线的制作取5支试管，编号。按下表加入各种试剂。编号01234酪蛋白母液/mL00.20.40.81蒸馏水/mL10.80.60.20Folin酚-甲5mL混匀后，30℃反应10minFolin酚-乙0.5mL混匀后，30℃保温30min在640nm处测吸光值，以A640值为纵坐标，酪蛋白浓度为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。3.酪蛋白含量测定称取提取出的酪蛋白0.1g，溶于1mL蒸馏水中，按下表进行操作。空白样品提取出的酪蛋白溶液/mL00.2蒸馏水/mL10.8Folin酚-甲5mL混匀后，30℃反应10minFolin酚-乙0.5mL混匀后，30℃保温30min在640nm处测吸光值，并带入标准曲线公式中，求得蛋白质含量。思考题 1.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2.为什么选择有机溶剂洗涤蛋白质沉淀？
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