生物化学实验指导：生化实验--枯草杆菌蛋白酶活力测定.pptxVIP

枯草杆菌蛋白酶活力的测定 实验目的 实验原理 实验仪器与试剂 实验步骤 思考题 一、实验目的 学习测定蛋白酶活力的方法 掌握72型或712型分光光度计的原理和使用方法 学习绘制标准曲线的方法 二、实验原理 酶活力概念：指专一性催化某种底物反应的能力，酶活力通常用一定条件下酶催化某种反应的反应速度来表示。 枯草杆菌蛋白酶活力单位定义：在30 ℃，pH 7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1μg酪氨酸为1U。 二、实验原理 钼蓝、钨蓝 Folin-酚试剂 酪氨酸 OH- 酪蛋白 蛋白酶 温度、pH 比色测定 三、器材仪器和主要试剂 仪器： 恒温水浴锅 721型分光光度计 试剂： Folin-酚试剂 0.55M碳酸钠溶液 10%三氯乙酸 0.5%酪蛋白溶液 500μg/mL酪氨酸溶液 蛋白酶液 四、实验操作 1、酪氨酸标准溶液的配制 C酪氨酸母液·V吸取=C酪氨酸配制·V容量瓶 eg. 配制10 μg/mL酪氨酸溶液， 100mL容量瓶 500 μg/mL ·V吸取=10 μg/mL ·100mL V吸取=2mL 即：吸取2mL 500 μg/mL 酪氨酸母液于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至100mL，形成10 μg/mL酪氨酸标液 四、实验操作 2、酪氨酸标准曲线的制作 管号 1 2 3 4 5 6 7(空白管) 酪氨酸浓度（μg/mL） 10 20 30 40 50 60 0 吸取酪氨酸体积（mL） 1 1 1 1 1 1 0 吸取蒸馏水体积（mL） 0 0 0 0 0 0 1 0.55M Na2CO3溶液（mL） 5 5 5 5 5 5 5 Folin-酚试剂（mL） 1 1 1 1 1 1 1 迅速混合，于30℃显色15min，测定A680 nm A680 nm 以酪氨酸浓度μg为横坐标，A680 nm为纵坐标，作出标准曲线y=ax+b。 图 1. 酪氨酸标准曲线 A B 。 。 四、实验操作 3、蛋白酶活力测定 管号 0.5%酪蛋白溶液(mL) 酶液(mL) 10% 三氯乙酸(mL) 30℃水浴10min 10% 三氯乙酸(mL) 室温放置15min，滤纸过滤得滤液 0.55M Na2CO3溶液（mL） Folin-酚试剂（mL） 迅速混合，于30℃水浴显色15min，测定A680 nm 8（样品） 2 1 0 3 5 1 9（对照） 2 1 3 0 5 1 事先30℃预热5min step1 step2 step3 四、实验操作 4、计算酶活力 规定在30℃，pH 7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为一个酶活力单位。则1g蛋白酶在37℃，pH 7.5的条件下所具备的总活力单位为： 酶活力单位数（U/g）=（A 样-A对）∙ K ∙ (V/t) ∙N 式中： A 样——样品液光吸收值 A对——对照液光吸收值 K ——标准曲线上光吸收为1时的酪氨酸质量， μg V ——酶促反应管的总体积，mL，本实验取6 t ——酶促反应的时间，min，本实验t=10 N ——酶液的稀释倍数，本实验N=1 五、思考题 使用分光光度计测定吸光值应注意什么？ 测定酶活力时，为何既要设置空白管，又要设置对照管。其作用分别是？ 测定酶活力时，加入三氯乙酸溶液的作用是什么？ END