实验十一底物浓度对酶促反应速度的影响.docxVIP

实验H^一底物浓度对酶促反应速度的影响 一、目的 验证底物浓度对酶促反应速度的影响，并学习双倒数作图法求Kmo二、原理 ―? +0 H 磷酸苯二钠碱性磷酸酶+ 磷酸氢二钠 苯酚三、主要仪器与试剂 (1)恒温水浴箱、试管、移液管、分光光度计二 (2)0. hng/ml标准酚液、碱性溶液(0. 5M NaOH)、0. 3% 4-氨基安替 比林、0.5%铁氧化钾、0. 1M PH10碳酸缓冲液、0.04M磷酸苯二钠、碱性磷酸酶。 四、操作 1、取试管7只，依下表加入各种试剂（ml）： o I nniivvvi 0. 04M 磷酸苯二钠 0. 050. 10. 20. 30. 40. 8 pH10 碳酸缓冲液 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 H20 1. 2 1. 15 1. 11.0 0.9 0.8 0.4 37℃水浴保温5min,然后各加入0. 1ml碱性磷酸酶液 底物终浓度 mM 0 1 2 4 6 8 16 自测值 0D 0. 150 0. 491 0. 7830.812 0. 934 1.074 计时,37℃水浴保温 15min。 ［注］终浓度计算：如II号管，40mM磷酸苯二钠加入O.hnl,试管中 溶液总量2nd,则 ［S］磷酸苯二钠二40X0. l/2=2mM 2、保温结束，立即加入碱性溶液Ind,终止反应。 3、各管中分别加入0.3%的4-氨基安替比林1ml, 0.5%铁氟化钾2ml, 充分混匀，静置昆min。 以0号调“0点”，于510nm比色，测得0D值。 由测得的0D值，在实验十画出的酚标准曲线上查找酚的含量（ug）, 以酚量代表该试管中酶 促反应速度（V）,也代表该试管中酶总活力单位（U）,即在37℃水浴保温15min产生lug的酚量 为1个酉每活单位（U）。 ［预实验测值］:酚饱和曲线 i nmwvvi OD 值 [S] 12468 酚量(ug)[酶活、V]12. 52233. 533. 737 4、以每管中酶促反应速度(V,即酶活单位、酚含量)做纵坐标，以 底物浓度[S]为横坐标在坐 标纸上作图，此为酚饱和曲线。 5、以酶活单位的倒数(即V、1/酚含量)做纵坐标，以底物浓度 的倒数1/[S]为横坐标在坐标 纸上作图，求碱性磷酸酶的Km值。 [预实验测值]:双倒数法求Km I IIIII1VVVI [S]1246816 1/[S]11/21/41/61/8 V ( yg)[酶活]12.52233. 533.737 0. 027 0.0296 0. 045 1/V0. 08 0.0298 酚饱和曲线双倒数图形五、安排与要求 2人做1份； 绘制2表、2图：酚饱和曲线测定的图表、双倒数法求取Km值的图 表。(上面的图表)下次实验请学生自带镶子、剪刀。 作业： 比色方法测定溶液浓度的基本原理是什么？已知物质标准液浓度测定 溶液未知浓度有几种方法？ 酶促反应与分光光度法介绍： (一)酶促反应 在温度、pH及酶浓度恒定条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大 影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(V )随底物浓 度(S )的增加而增加，但当底物浓度继续增加时,反应速度的增加就比较 小，当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值最大速度 (Vmax)o 米氏方程(Michaelis —Menten)] [][max S K S V V m +-=米氏常数是反应速度(V )等于最大反应速 度一半时的底物浓度，它是酶的特征性常数。大多数酶的K m值在10- 1^10-6mol/L 之间。将 Michaelis -Menten 变形成 Lineweaver -Burk 方程式： max max 1］［11V S V K V m +-=［酶促反应速度］单位时间内，单位体积 中底物的减少量或产物的增加量，浓度/单位时间。酶促反应速度仅在最 初阶段保持恒定，随着时间延长酶促反应速度下降：底物浓度I、酶失活、 产物浓度t、产物对酶抑制。 底物浓度与酶促反应速度的关系：一级反应（二者正比）一混合级反 应（非正比性增加）一零级反应（V达到极限值，此时酶已被底物饱和）。 ［醮活力］指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它 所催化的某一反应的反应速度来表示。测定酶活力就是测定酶促反应速度。 （二）分光光度法 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的 一门技术。 物质对光的吸收具有选择性，各种不同的物质都具有各自的吸收光谱。 当某单色光通过溶液时，其透射光强会减弱。因为有一部分光在溶液的表 面被反射或散射，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可 透过溶液。入射光二反射光+散射光+吸收光+透射光如果用蒸储水（或组成 此溶液的溶剂）作为“空白”去校