11第十一章-PCR基因扩增技术.pptxVIP

现代食品检测技术第十一章PCR基因扩增技术/38目录第一节PCR技术的原理第二节PCR引物的设计第三节PCR反应条件与程序优化第四节PCR扩增产物的检测分析第五节PCR技术的发展第六节PCR技术在食品微生物检测中的应用第七节PCR技术在转基因食品检测中的应用/38PCR技术聚合酶链反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是由美国Cetus公司人类遗传学研究室的科学家Kary B. Mullis在1985年发明的一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。自诞生以来，PCR技术已由最初的单纯扩增已知DNA序列之间的片段逐渐发展到基因克隆、修饰，cDNA文库构建，遗传病、传染病诊断，病原菌鉴定，法医学鉴定，过敏原检测，生物物种鉴别，转基因检测，生物进化分析等各个领域的多种PCR方法，为生命科学领域的新突破和技术变革提供了有力的技术支撑。第一节 PCR技术的原理/38一、 PCR的基本原理PCR的原理并不复杂，实际上它是在体外试管中模拟生物细胞DNA复制的过程。PCR反应极其迅速，可在短短几小时内将极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段扩增上百万倍。PCR的特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增的DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是单链DNA片段。在微量离心管中，除加入与待扩增的DNA片段两条链两端已知序列分别互补的两个引物外，还需加入适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时首先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态，称为变性；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对（复性），形成部分双链，称为退火；此时，两引物的3′相对，5′相背，在合适的条件下，以dNTP为原料，由耐热Taq DNA聚合酶催化引导引物沿5’-3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作下一轮反应的模板，此即引物的延伸。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR是一个在引物介导下反复进行热变性一退火一引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程(图11-1)。第一节 PCR技术的原理/38图11-1 PCR反应原理及其长产物片段和短产物片段第一节 PCR技术的原理/38（一）模板DNA变性模板DNA在加热到90~95℃时，DNA双螺旋结构的碱基对之间氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。变性温度与DNA中G-C含量有关，因为G-C之间由三个氢链连接，而A-T之间只有两个氢键相连，所以G-C含量高，其解链温度（Tm）就高。一般G-C含量每增加1%，解链温度增加0.4℃。哺乳动物基因组DNA中G-C含量在40%时，Tm约为87℃；其含量在60%时，Tm约为95℃。DNA变性所需要的温度和时间取决于DNA的复杂性、G-C的含量和PCR反应的体积等。在一般PCR中，变性温度为90~95℃，加热时间1~2min。（二）模板DNA与引物的退火（复性）将反应混合物降温（37~65℃），使寡核苷酸引物与单链DNA模板(或从mRNA逆转录而来的cDNA)上互补的序列配对，形成模板—引物复合物，即退火。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及其碱基组成。一般要求引物的浓度要远高于模板DNA的浓度。并由于引物的长度远短于模板DNA的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为l~2min。第一节 PCR技术的原理/38（三）引物的延伸PCR扩增过程中，链的延伸是有方向性的。它总是以引物的3’端为起点，DNA模板—引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以靶序列为模板，dNTP为底物，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链，新链延伸的方向是5ˊ→3ˊ，延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。经过上述高温变性—低温退火—中温延伸这样一个循环，模板DNA拷贝数增加一倍，新合成的DNA链在下一轮循环中也起着模板的作用，因此，每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍(×2)。n次循环后，拷贝数增加2n倍，进行25~30个循环，拷贝数即可扩增上百万倍(106)，扩增的DNA片段长度基本上都限定在两引物5′端以内，在凝胶电泳上显示为一条特定长度的DNA区带。每完成一个循环需2~4min，一次PCR经过30~40次循环，约2~3h。第一节 PCR技术的原理/38（四）PCR的反应动力学PCR反应过程中的DNA扩增量可用Y＝（1十X）n计算。Y代表DＮA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为l00%，但在实际反应中，扩增产物