酯酶的分离、纯化与活性测定.pdfVIP

酯酶的分离、纯化与活性测定 采用CM-纤维素离子交换剂柱层析，以梯度洗脱方法从植物组织中分离和纯化酯酶。 1.仪器设备 玻璃层析柱、分光光度计等。 2.操作方法 1）粗酶制剂的制备 2）CM-纤维素离子交换剂的处理：称 10gCM-纤维素干品置于烧杯中，加入 100ml0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl 溶液，混匀，静置 10min 后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤渣至中性。再将滤 渣悬浮于100ml 0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl 溶液中，混匀，静置 15min 后放入布氏漏斗抽滤， 水洗滤渣至中性。最后将滤渣悬浮于所选择的起始缓冲液中。 3）层析柱的安装与平衡：取1.5×40cm 的玻璃柱，以CM-纤维素装柱约30cm，用起始缓冲液平 衡10h 左右。 4）加样和梯度洗脱：用滴管将4ml 粗酶制剂溶液 （总蛋白质含量15mg）沿柱内壁徐徐加到纤 维素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夹，使样品液面降至纤维素柱表面，再加入少许洗脱起始缓冲 液洗涤柱壁，如上操作，反复进行2 次。 -3 -1 以5×10 mol/L～1×10 mol/LpH6.0磷酸缓冲液（各150ml）作直线梯度洗脱。流速控制在2ml/20 min。以部分收集器收集，每管收集2ml 流出液。实验在0～10℃的温度范围内进行。测