谷酰胺合成酶的提取和活性测定.pdfVIP

谷酰胺合成酶的提取和活性测定 谷酰胺合成酶 （GS）和天冬酰胺合成酶是催化谷酰胺和天冬酰胺水解与合成的酶。动物各 组织、酵母、细菌和植物中均有这两种酶存在，它们在这些生物体内的氮代谢中起要作用。 谷酰胺合成酶通过生物合成方式催化γ-谷氨酰基氧肟酸 （γ-glutamylhydroxama 的形成，后 者与FeCl 结合成有色化合物，用分光光度计 （λ 540nm）测其光密度，便可γ-谷氨酰基氧肟酸 3 生成量，从而推算该酶活性。反应如下： 1.仪器设备 高速离心机、分光光度计、超声击碎器等。 2.操作方法 1）酶粗提液的提取：材料可用根瘤菌、固氮菌、蓝藻、酵母等。以根瘤菌或酵母为例，菌 悬浮培养物冰冷后，在0～4℃下用 10000×g 离心10min，弃去上清液，用少量5mmol 磷酸缓冲 液 （pH7.2，内含0.5mmol/L EDTA，50mmol/LK SO ）离心洗涤3 次，在液氮贮存。用时，先 2 4 在30℃下熔化，再悬浮于上述磷酸缓冲液中，用超声破碎器破碎 （14mA）5min，用35000×g 冷 冻离心15min，得上清液，供测酶活。或用少量上述磷酸缓冲液离心涤3 次，加5ml