弯曲乳杆菌蛋白酶分离纯化技术规范.pdfVIP

弯曲乳杆菌蛋白酶分离纯化技术规范 1 范围 本文件规定了弯曲乳杆菌蛋白酶分离纯化的材料与试剂、仪器与设备、盐析、阴离子交换层析和纯 化。 本文件适用于实验室中弯曲乳杆菌蛋白酶的分离与纯化。其他菌株蛋白酶的分离纯化可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 材料与试剂 材料 弯曲乳杆菌发酵液。 试剂 4.2.1 除非另有说明，本方法中使用的试剂均为分析纯。实验室用水应符合GB/T 6682 中规定的三级 水。 4.2.2 盐酸溶液（HCl）：1mol/L、2 mol/L。 4.2.3 氢氧化钠溶液（NaOH）：2 mol/L。 4.2.4 硫酸铵溶液[ （NH ）SO ]：80％饱和度。 4 2 4 4.2.5 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液 （Tris-HCl）：20 mmol/L，pH=7.0。 4.2.6 含氯化钠三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（NaCl Tris-HCl）：氯化钠浓度1.0 mol/L，pH=7.0。 4.2.7 磷酸二氢钠溶液 （NaH₂PO ）：50 mmol/L。 4 4.2.8 氯化钠溶液 （NaCl）：0.10 mol/L。 5 仪器与设备 试管：50 mL。 烧杯：500 mL。 移液管。 1 pH 试纸。 天平：感量0.01 g。 高速冷冻离心机：温度≤4 ℃，转速≥10 000 r/min，配离心管。 冰箱：控温精度0.5 ℃。 梯度洗脱仪。 恒流泵。 紫外分光光度计。 酶标仪。 层析柱：3.0 cm×40 cm，DEAE-Sepharose Fast Flow 填料。 凝胶过滤柱：Sephadex G-75 粉末，1.8 cm×40 cm。 分部收集器。 恒温水浴锅：温度范围20 ℃～100 ℃。 真空泵。 旋转蒸发仪：转速范围20 rpm～280 rpm，温度范围20 ℃～180 ℃。 氮气吹干仪：水浴式，温度范围20 ℃～100 ℃。 真空冷冻干燥机：冷阱温度-50 ℃。 6 盐析 将发酵液于4 ℃温度下10 000×g离心10 min，收集上清液，于搅拌下逐滴加入500 mL硫酸铵溶液， 于4 ℃冰箱静置沉淀6 h，6 h后于4 ℃下10 000×g离心15 min，弃去上清液得粗酶液。 7 阴离子交换层析 填料预处理 7.1.1 向DEAE-Sepharose Fast Flow 填料中加入2 mol/L 盐酸溶液浸泡1 h，倾倒去除盐酸溶液，用 水洗涤至洗涤液用pH 试纸测试呈中性。 7.1.2 向DEAE-Sepharose Fast Flow 填料中加入2 mol/L 氢氧化钠溶液浸泡1 h，倾倒去除氢氧化钠 溶液，用水洗涤至洗涤液用pH 试纸测试呈中性。 7.1.3 用Tris-HCl 缓冲液浸泡DEAE-Sepharose Fast Flow 填料，待用。 装柱 将层析柱垂直放置，关闭出水口，加入层析柱体积1/2的水，将100 mL DEAE-Sepharose Fast Flow 填料连续缓慢地从上口沿柱壁加入层析柱中，同时打开出水口，使DEAE-Sepharose Fast Flow填料自然 沉降。 平衡 连接恒流泵，用20 mmol/LTris-HCl缓冲液以1.5 mL/min流速平衡层析柱6 h。 加样 7.4.1 平衡完成后，打开层析柱上盖，将液面放至 DEAE-Sepharose Fast Flow 填料上方 2 mm～3 mm 处；用移液管吸取粗酶液0.5 mL 沿柱壁四周缓慢加入层析柱中，将液面放至DEAE-Sepharose Fast Flow 填料上方约1 mm 处，重