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摘要
摘 要
背景:CXCR3是GPCR 趋化因子受体家族的成员,在人体免疫调控、疾病
及肿瘤的发展中扮演着重要角色,其结构研究对未来分子靶向药物开发具有巨大
的潜在价值。然而,目前未见有研究CXCR3三维结构的相关报道,解析CXCR3
结构有助于深入了解其激活机制并为相应的药物研发提供重要的结构基础。
目的:研究趋化因子受体CXCR3 在Sf9 昆虫细胞中的表达与纯化,研究
CXCR3-CXCL10-G 蛋白复合物在负染电镜下的结构,为开发其作为分子靶向药i
物提供理论基础及实验依据。
1 CXCR3 pFastBac1
方法: 、合成人源 基因,构建不同克隆到 载体中,在
3.41
Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒表达系统中进行蛋白表达。2、通过引入L140 W,
4.60 6.33 7.42
D186 N,A253 E,G307 A 四个位点氨基酸突变,在CXCR3 的N 端或者C
端进行氨基酸截短等多种方式优化克隆,以提升CXCR3 的蛋白表达量、均一性
和稳定性。3、进行盐浓度筛选优化纯化条件,经过固定化金属离子亲和层析及
尺寸排阻层析法鉴定,得到高产量、稳定表达的CXCR3 蛋白。4、在Sf9 细胞
CXCL10 G CXCR3
中共表达天然配体 、 蛋白与i ,通过对表达及纯化条件的优化,
得到CXCR3-CXCL10-G 蛋白复合物,并通过负染技术研究CXCR3激活态的均i
一性和稳定性。
1 His CXCR3 pFastBac1-Z
结果: 、将带有 标签的 基因成功构建到 表达载体
上,利用Bac-to-Bac 杆状病毒系统在Sf9 昆虫细胞内成功表达CXCR3 蛋白。2、
使用DDM 提取纯化CXCR3 蛋白,筛选出CXCR3 最优表达克隆及最优纯化条
SDSWestern-Blot CXCR3
件,通过 、 鉴定证实纯化得到的蛋白为 蛋白,
得到的蛋白性质稳定、产量高。3、在Sf9 昆虫细胞内进行CXCR3-425、CXCL10、
Gi 的共表达,纯化得到复合物蛋白并用于负染电镜观察蛋白颗粒,为复合物结
构研究奠定基础。
结论:本研究构建不同克隆和纯化条件优化得到了均一性和稳定性良好的
CXCR3 蛋白,并在负染电镜下观察CXCR3-CXCL10-G 蛋白复合物结构,为i
CXCR3 结构研究打下了良好的基础。
关键词:CXCR3;表达纯化;Gi 复合物;冷冻电镜;趋化因子受体
II
目录
目录
第一章 引言1
1.1GPCR 家族1
1.2 趋化因子受体家族1
1.2.1 结构研究2
1.3CXCR33
第二章 CXCR3 蛋白的表达载体构建5
2.1引言5
2.2 实验材料5
2.2.1实验仪器5
2.2.2 实验试剂耗材6
2.3 实验方法7
2.3.1 目的蛋白序列分析7
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