树枝状两亲性肽自组装凝胶诱导基因转染的BMSCs向神经元及血管内皮细胞转分化研究.pdfVIP

摘要 摘 要 目的： 将分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞 （BMSCs ）进行 VEGF165 、NT-3 及 Ang-1 基因转染并接种于树枝状两亲性多肽（B-PA ）自组装水凝胶进行共培养 ， 观察细胞在水凝胶内、在VEGF165 、NT-3、Ang-1基因诱导下向血管内皮细胞及 神经细胞转分化。以期待构建合成的树枝状两亲性肽可作为脊髓组织工程支架。 方法： 1、从 2 1 天大鼠骨髓中分离、培养骨髓间充质干细胞 (BMSCs ），用倒置相 差显微镜观察细胞形态，采用流式细胞术对骨髓间充质干细胞进行鉴定；同时将 细胞催分化，使用油红O 染色及茜红素S 染色对细胞干性进行鉴定。 2、采用固相自动多肽合成仪(SPPS)上合成特定的 B-PA ，并运用高效液相色 谱(HPLC） 与质谱仪（MS)对其进行表征进行分析。配制不同质量分数的B-PA 溶 液，观察不同质量分数的B-PA 溶液成型能力，并对凝胶进行晾干并用透射电镜显 微（TEM )观察水凝胶内部结构； 3、将大鼠BMSCs 进行VEGF165 、NT-3 及Ang-1 基因转染并接种于b-PA 自组装凝胶内部，采用 Calcein-AM/PI （死活细胞检测试剂）对共培养的转染后 的BMSCs 染色，用荧光显微镜观察细胞存活情况。采用CCK-8 （细胞增殖实验） 测不同浓度的 B-PA 水凝胶中转转染后的BMSCs 的细胞增殖和细胞毒性作用； 采用 Hochest 33342 染色检测水凝胶对转染后的BMSCs 的粘附能力； 4 、将转染Adv-Bic 及AdvNT-3 的BMSCs 与B-PA 水凝胶体外共培养 7 d 后 免疫荧光及 qRT-PCR 检测。 结果： 1、倒置显微镜下可见提取细胞呈骨髓间充质细胞表现；流式细胞术检测结 果显示：培养细胞表面分子 CD29、CD44 呈阳性表达，将成脂和成骨诱导分化 后的细胞分别行茜素红染色及油红 O 染色。镜下可以看到大量钙结节形成（A 组）；发现细胞内出现脂滴（B 组）。 2 、合成 b-PA 的分子纯度极高（95.8507% ），1wt%b-PA 溶液形成的凝胶粘 II 摘要 弹性极好，紧贴瓶壁； 3、水凝胶与细胞共培养后 cck-8 检测、活死细胞染色显示水凝胶毒力小， 细胞增值可，细胞粘附实验证明水凝胶（B-PA ）粘附效果好； 4 、免疫荧光及qRT-PCR 显示：细胞在凝胶内部可高表达VEGF165 、NT-3 及Ang-1，CD31+/34+ 、NSE 及Nestin 均明显增加： 结论： 树枝状两亲性肽（B-PA ）形成的水凝胶具有诱导转染 VEGF165 、NT-3 及 Ang-1 基因的BMSCs 向神经元细胞及血管内皮细胞方向分化的能力。 关键词：B-PA ；自组装；BMSCs ；基因转染；神经元细胞；血管内皮细胞 III 目录 目 录 第1 章 引言1 第2 章材料与方法2 2.1 主要材料和试剂2 2.1.1 实验动物2 2.1.2 细胞2 2.1.3多肽合成2 2.1.4主要实验试剂配置2 2.1.5主要试剂及产地3 2.1.6 主要设备及产地3 2.2 实验方法3 2.2.1 原代BMSCs 的分离、培养3 2.2.2 原代BMSCs 的传代4 2.2.3 BMSCs 鉴定5 2.2.4 B-PA 的设计、合成、检测6 2.2.5 B-PA水凝胶