小型发酵罐分批培养大肠杆菌及其动力学参数的检测.docVIP

河北科技大学实验报告 毕 业 设 计（论 文）开 题 报 告 小型发酵罐分批培养大肠杆菌及其动力学参数的检测 一、目的要求 1、了解小型发酵罐的基本结构。 2、学习和掌握发酵罐的使用方法。 3、了解大肠杆菌培养过程的代谢变化。 4、掌握大肠杆菌培养过程动力学参数的测定和计算方法。 二、基本原理 发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的，基本结构是类似的。以此实验用发酵罐为例，说明小型发酵罐的结构。 大肠杆菌是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。本实验学习用大肠杆菌在小型发酵罐内进行发酵的方法。通过控制合适的培养条件，可使大肠杆菌迅速持续地生长，获得所要求的高产培养物。 发酵动力学是研究发酵过程变量在微生物细胞的作用下的变化规律，以及各发酵条件对菌体生长、基质消耗、产物生成的变化速度的影响。为了动态地了解发酵过程中过程变量的变化，需在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度、残留的还原糖及氨基氮等参数变化，根据实验结果，可通过动力学方程推算动力学参数。 三、实验材料 （一）菌种：大肠杆菌 （二）培养基： 种子培养基组成： 蛋白胨1% 牛肉膏 0.3% NaCl 0.3% 葡萄糖 0.5% KH2PO4 0.05% 最终调PH值至7 发酵培养基组成： 蛋白胨1% 牛肉膏0.3% NaCl 0.3% 葡萄糖1% KH2PO4 0.05% 最终调PH值至7。 制备2升分出200mL至500ml三角瓶中，做种子培养基。(第一天上午) （三）仪器设备 3BH离体式发酵罐，722型分光光度计，旋转式摇床，37℃温控箱等。 （四）试剂 消沫油、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等； 葡萄糖测定试剂盒、5.5mmol/L标准葡萄糖液。 四、实验方法 1．种子培养 培养条件：500ml三角瓶装液量200ml，初始pH为7.0，种子培养基配制完成后分装三角瓶，在112℃下，杀菌15min（第一天上午）。 接种（第一天下午）：如果种子培养基所接是保存斜面种子，用接种环从保存斜面中接几环至三角瓶中，若由种子瓶直接接种至发酵罐，需由发酵液体积计算种子瓶的个数，周期18h。 2．发酵罐的准备（第一天上午） 接种与培养（第二天上午） 将酒精棉或酒精置接种口槽中，点燃，进行无菌接种，接入200ml种子。接种后立即进行第一次取样。 发酵过程各发酵参数的测定。（第二天下午） 发酵过程中，虽然自动控制温度，但仍需专人负责照看。完成下列工作： （1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。 （2）随着培养时间的延长，适当地调节进气量和搅拌转速，以维持一定的DO值。 （3）自培养操作开始起，每1~2h取一次样。取样时，将取样管口流出的最初8ml左右培养液作为废液，取随后流出的培养液5ml。然后放入冰箱保存，以测定菌体浓度及糖浓度（第二天上午） （4）从冰箱取出样品，用试管或离心管取出一部分，用pH计测定pH值。 （5）菌体浓度的测定：取发酵液，样品用7ml离心管稀释一倍后，在600nm下测定吸光度，测定菌体浓度，以0小时发酵样调零。 （6）测定残糖浓度：用葡萄糖测定试剂盒测定培养液中还原糖的含量。 ＧＯＤ测定原理： ＧＯＤ β-D葡萄糖+O2+H2O D-葡萄糖酸+H2O2 ＰＯＤ H2O2+ 4-AAP＋苯酚 红色醌化物+H2O ＰＯＤ 生成的醌类化合物颜色的深浅与葡萄糖的含量成正比，分别测定标准管和样品管的吸光度值，计算葡萄糖的含量。 具体方法如下： 准确量取1ml发酵液于7ml’离心管中，4000转离心离心4min。上清液用来测定糖浓度，测定反应体系如下面表格。 加入物（ｍL） 空白管 （当做调0空白） 标准管 (已知葡萄糖浓度） 测定管（1,2,3,4,5） 标准液 ———— 0.020 ———— 样　品 ———— ————— 0.020 酶试剂 1.50 1.50 1.50 酚试剂 1.50 1.50 1.50 混匀后于37℃保温5分钟，在505nm下测定吸光度，以空白管调零，测定各管的吸光度值。 计算：Ａ样 Ａ样 Ａ标葡萄糖含量＝ ×标准液浓度 Ａ标 标准液浓度1000mg／L（5.55mmol/L） 五、实验报