(18)--7-原核细胞表达系统生物技术制药.pptVIP

基因工程菌的构建-原核细胞表达系统 学习目标熟悉并掌握如何构建有效的原核表达系统理解并识记原核表达系统优缺点 蛋白表达系统以实现外源基因在宿主中表达为目的，由宿主、外源基因、载体和一些辅助成分共同组成的体系1973年，S. Cohen等首次将含卡那霉素抗性基因的质粒和含四环素抗性基因的质粒连接，转入大肠杆菌，使其获得两种抗性。外源基因在大肠杆菌中成功表达基因工程元年 原核表达系统已建立原核表达系统大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等主要优点宿主菌遗传背景清楚，商品化菌种齐全，方便购买原核细胞操作简便、繁殖快和周期短大规模生产成本低，产量较高下游纯化工艺简单，易于控制，生产效率高 目的基因结构与形式启动子外显子内含子外显子外显子内含子编码区非编码区非编码区cDNA：在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。与基因组DNA不同，cDNA没有内含子而只有外显子的序列原核表达体系选取目的基因时，要选用cDNA 目的基因结构与形式密码子偏爱性：只选用同一种氨基酸同义密码子中的1~2种，称为偏爱密码子稀有密码子：不被经常利用的密码子称为稀有或利用率低的密码子大肠杆菌稀有密码子：AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC密码子表 表达载体选择与构建理想表达体系强而可控的启动子核糖体结合位点转录终止信号较高拷贝数稳定性好表达产物易纯化常见启动子：lac、trp、tac、PL/PR、T 7 基因工程常用工程菌：经改造的限制系统和重组系统缺陷的细菌选择菌株依据原则：菌株与表达载体配套外源表达蛋白稳定性：考虑蛋白酶缺陷型菌株作为起始表达菌株外源基因的结构目的蛋白的结构宿主菌的选择 外源基因表达形式胞内表达：融合型表达载体——融合蛋白非融合型表达载体——天然完整蛋白胞外表达：分泌型表达载体——产物可跨膜分泌至胞周间隙 非融合表达载体非融合表达：外源基因的一种独立表达形式，不与细菌的任何蛋白质或多肽融合在一起进行表达，即将外源基因直接克隆与启动子和SD序列的下游进行表达易被蛋白酶降解可能形成不溶性包含体PSD目的基因终止序列 融合表达载体融合表达：将一段特殊的蛋白质或短肽的基因构建入载体，使之与目的蛋白连接表达形成融合蛋白融合蛋白在大肠杆菌内较稳定，表达效率提高原核短肽设计为可用于亲和纯化的标签，从而大大简化融合蛋白的纯化可以通过化学方法或蛋白酶法切除融合蛋白中特殊蛋白质，形成具有活性的目的蛋白PSD目的基因终止序列编码特殊蛋白基因 胞外表达通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列的下游实现分泌分泌至周质周质腔中蛋白酶含量少，蛋白稳定性高表达量较胞内低可能形成包含体分泌至胞外（培养基中）可直接分析培养液中重组蛋白水平下游纯化步骤简单 原核工程菌筛选个体水平筛选抗生素抗性筛选法α-互补筛选法营养缺陷性筛选法噬菌斑筛选法分子水平筛选核酸分子杂交法PCR方法限制性内切酶谱法DNA序列测定法蛋白水平筛选酶联免疫吸附分析免疫组化分析 总结目的基因结构与形式表达载体选择与构建宿主菌的选择原核工程菌的构建外源基因表达形式原核工程菌筛选 感谢聆听