(19)--SDS-PAGE电泳Westernblot技术生物化学与分子生物学.pptVIP

上 样 加入电极缓冲液 垂直拔出样品梳 按样品-标准蛋白-空-样品的顺序上样，样品分别加10ul，标准蛋白20ul 电泳： 浓缩胶80V，分离胶120V电泳，当溴酚蓝指示剂前沿到达距底部1cm左右时，停止电泳,需要3-4h。 切胶：电泳完毕，取出胶，切出两条胶带，一条含样品及标准蛋白，用考马斯亮蓝R250染色；另一条含样品的胶条用于转印和酶联免疫染色。 胶条保存： 将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20℃ 冻存 先纵切再横切！ 溴酚蓝 前沿 安全注意事项 1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，注意不要沾在皮肤上，如有沾染可用水洗净。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。 2. 药品使用后必须盖好放回原处！ 3. 电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断铂电极丝。 4. 注意保护玻璃板。 5. 电泳完毕后的凝胶必须扔到垃圾桶中，不能扔在水槽中。 作业： 1.叙述SDS电泳的原理及操作过程。 2.叙述Western blot的原理及操作过程。 过硫酸胺提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基；TEMED催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合 * 灵敏度可与最好的银染法相媲美 * 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用的大胶比较困难。关于转膜的注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极； 2.转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放4 ℃ 冰箱； 4.滤纸不要大过膜，防止短路； 5.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全； 6.注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉； 7.在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 关于转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA,上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 * 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。这时，可改用其他检测方法或换用丽春红S。 转膜后检测，多用丽春红染色，可见多条粉红色条带。 按照所检测蛋白分子量大小切下膜条，做好标记。 * 4. 封闭(Blocking) 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常用的封闭试剂有 5%的 BSA 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST 或者TBST。 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 一般封闭条件为：