外周血DNA的提取课件[].pptVIP

外周血中DNA的提取与鉴定 实验目的1. 掌握人全血DNA提取的原理和操作步骤。2. 了解DNA基本理化性质。3.3. 初步了解DNA琼脂糖电泳鉴定的方法。 实验原理DNA提取总的原则1 保证DNA一级结构的完整性；2 其他生物分子如蛋白质、多糖和脂类等分子的污染应尽量降低到最低；3 尽量去除对后续分子实验有抑制作用的有机溶剂和重金属离子；4 其他核酸分子RNA，应根据实际需要处理。 实验原理样本来源? 理论上所有真核细胞、原核细胞、病毒等都可以提取DNA。? 样本选择取决于实验目的。? 全血是基因组提取中最常见的样本之一。 理化性质核酸是由碱基、戊糖及磷酸组成的生物大分子，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两类。1. 酸碱性核酸分子中有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基，属于两性化合物，但是磷酸基的酸性较强，所以核酸总体上表现为酸性，带负电荷。2. 溶解度与粘度核酸是极性化合物，微溶于水，其钠易盐溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有机溶剂。核酸是高分子化合物，粘度很大。3. 紫外吸收核酸有强烈的紫外吸收，其最大吸收峰在260nm处，常以A 表示。260 实验原理生物的大部分或几乎全部的DNA都集中在细胞核或核质体中，人与动物的DNA主要存在于细胞核中，并与蛋白质结合的构成大小不一的染色体。所以蛋白质是DNA提取过程中常见的污染之一，而且蛋白质污染常常影响到以后的DNA操作过程，因此提取过程中要把蛋白质去除。 实验原理本实验中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法。基本原理就是苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA却没有影响。经苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相与水相完全分层，蛋白质变性而被离心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于酚/氯仿相，从而与水相分离得以去除。 实验原理此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质，但是RNA极易降解。而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响，如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。 实验步骤1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL, 按照1:5～1:10的比例加入去离子水裂解8min，然后1700rpm/min离心，去掉含有红细胞碎片的上清液，重复裂解一次，留取白细胞沉淀。 实验步骤2.加入0.5mL的DNA细胞裂解液来悬浮白细胞沉淀。 实验步骤3. 悬浮后的溶液中添加蛋白酶K20μL，65℃水浴0.5h，期间轻缓地倒转几次。。4. 室温下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液，剧烈地震荡混合10min，然后8000rpm/min离心10分钟，然后将水相移至新的离心管中。 实验步骤5. 添加1mL的预冷的无水乙醇到水相中，混匀，8000rpm/min离心3分钟。6. 沉淀用70%的预冷乙醇洗涤两次，然后干燥，最后用50μL去离子水悬浮。 实验步骤7. 用1%的琼脂糖电泳鉴定所提取的DNA。8. 剩余的DNA贮存在4℃冰箱中,备用。