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模块七典型产品第1页/共102页 模块七 典型产品第2页/共102页 基因工程制药概 况基因工程产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。第3页/共102页 基因工程产品生产流程工程菌选择设计发酵反应器选择培养方式确定发酵培养基组分工艺优化与参数监控计算机的应用生物催化剂的使用产品分离、纯化基因工程药物的质控第4页/共102页 工程菌选择能用一般基因重组技术获得；有高产潜力；能以工业原料（碳源）为培养基；生产工艺能用一般工业生产经验；能产生、分泌蛋白质；不致病、无毒性；生产安全，符合国家卫生部门规定；代谢能控制；产品有特异性；发酵液黏度小；第5页/共102页 甲醇营养型巴斯德毕赤酵母表达系统具有甲醇精确诱导调控的醇氧化酶（AOX）启动子PAOX；以甲醇作为唯一碳源和能源是其主要特征；三个阶段非常明显：生长期（不流加） 、分批-补料培养、 诱导表达。表达产物的糖基化（糖蛋白，修饰加工，对重组蛋白的稳 定性，免疫原性，生物活性均有影响） ；有50%～70%的把握在毕赤酵母系统表达绝大部分蛋白， 且达到相当水平，其中大部分可成为医药制品。第6页/共102页 选择培养方式（1）补料分批培养：注意溶氧、流加补料；（2）连续培养：两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性。第7页/共102页 与基因工程菌培养有关的几个问题一 、基因工程菌生长代谢的特点（1）菌体生长速率反映蛋白质的合成速度；（2）控制菌体生长可提高质粒稳定性，减少代谢副产物的积累 和提高外源性蛋白产率；（3）能量的供应决定菌体的最大比生长速率；（4）小分子前体和催化组分的限制决定菌体的最大比生长速率。二、菌体生长与能量（碳源）的关系第8页/共102页 （1）菌体生长最大比生长速率由呼吸控制；（2）菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，代谢副产物乙酸 能抑制菌体的生长，尤其在高密度培养时；（3）分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中 控制稀释速率等；通过降低供能速度和前体供应速度来控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免乙酰辅酶A的积累，减少乙酸产生和抑制；在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。第9页/共102页 三、高密度细胞培养策略（1）使用最低合成培养基；（2）控制比生长速率 减少乙酸和乙醇等抑制性产物的积累， 使碳源能更多地用于异源蛋白的表达；对分批-补料培养， 控制补料流速；对连续培养，则控制稀释率D；（3）用碳源做限制性基质 。四、菌体生长与前体的关系（1）培养基中加入氨基酸能提高菌体比生长速率，使蛋白合成 增加。第10页/共102页 （2）由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞 竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足；（3）在中等拷贝质粒（56）工程菌中，外源基因的复制、转录、翻译引起 菌体内前体浓度的降低，可诱导与前体合成有关的酶相对水平增加（与 宿主细胞比）。（4）在高拷贝质粒（240）工程菌中，前体大量被利用而引起不足，产生 “严紧反应”（ppGpp），核糖体及有关酶水平比宿主细胞低。同样的培养基，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导基因表达后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。第11页/共102页 基因工程药物的产品分离、纯化（1）目的产物在初始物料中含量较低；（2）含目的产物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差，易失活/变性；（4）生物活性物质种类繁多；（5）应用面广，对质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等； 因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。第12页/共102页 分离纯化的基本过程分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过4～5个步骤，包括:细胞破碎固液分离浓缩与初步纯化高度纯化直至得到纯品成品加工第13页/共102页 发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离细胞分离碎片包含体变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品第14页/共102页 基因工程药物的质控原材料的质量控制原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自