DB32-T 3762.12-2021新型冠状病毒检测技术规范 第12部分：药物体外抗病毒效果测定.docxVIP

DB32/T 3762.12-2021 PAGE 4 新型冠状病毒检测技术规范 第12部分：药物体外抗病毒效果测定 范围 本文件规定了新型冠状病毒药物体外抗病毒效果测定环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、技术要求、操作步骤和清场与消毒。 本文件适用于新型冠状病毒药物体外抗病毒效果测定。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册 中华人民共和国国家卫生健康委员会 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 细胞病变效应 cytopathic effect，CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体，乃至细胞裂解等。 感染复数 multiplicity of infection，MOI 感染时病毒和细胞数量的比值。 半最大效应浓度 half-maximal effective concentration，EC50 能引起50%最大效应的药物浓度。 半数细胞毒性浓度 Half-cytotoxic concentration，CC50 对半数细胞产生毒性作用的药物浓度。 最大无毒浓度 maximal atoxic concentration，TC0 不引起细胞毒性的最大药物浓度 选择指数 selectivity index，SI 为判断药物效果的安全范围，SI=CC50/EC50，选择指数越大，药物的安全范围越大。 环境与设施 实验室资质及级别要求 应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定等实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。使用病毒培养物提取核酸，裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行，裂解剂或灭活剂加入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。病毒核酸荧光PCR检测程序可参照DB32/T 3762.3进行。 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训，操作活病毒人员应取得BSL-3实验室进入资质和相关实验活动上岗证。操作人员在健康状态良好的情况下经实验室主任批准后方可开展活动，应根据《新型冠状病毒实验室生物安全指南》要求，按照BSL-3个人防护的要求进行防护。 设备与耗材 设备 生物安全柜、倒置显微镜、涡旋振荡器、水浴或金属浴、冰箱、CO2培养箱、离心机、核酸提取仪、荧光定量PCR仪、微量移液器等。 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、医用防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶手套、防水靴套、带滤芯Tip头、一次性平皿、EP管、96孔细胞培养板、96孔PCR反应板等。 试剂与材料 试剂 Hanks溶液（每毫升含青霉素、链霉素各2000单位） DMEM培养液（含10 %胎牛血清）。 DMEM维持液（含2 %胎牛血清）。 消化液 （0.25 %胰酶和0.025 % EDTA-Na2混合液）。 核酸提取试剂盒。 新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒。 材料 新型冠状病毒培养物。 待检药物和阳性对照药物（瑞德西韦）。 非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）。 技术要求 病毒滴度质控：确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果。 效果指标选择：药物体外抗病毒效果可通过观察病毒致CPE、细胞活性染色、病毒噬斑减少试验、病毒抗原测定、病毒核酸测定等方法来判断，本文件通过病毒核酸测定来评价药物体外抗病毒效果。 毒性测定方法：药物对细胞的毒性测定可根据药物特点选用细胞病变观察或细胞活性染色（中性红、MTT或CCK-8等染色后测OD值）的方法进行。 预处理要求：如果待测药物是中药煎剂，必须进行无菌过滤以去处药液沉渣，以免影响结果观察。 操作步骤 药物对细胞的毒性测定 将实验所需细胞于96孔培养板中置37 ℃ 5 % CO2培养箱培养至单层，覆盖度80%左右，弃掉细胞培养液。 待检药物稀释：将待检药物用细胞培养液做倍比稀释，使其稀释度分别为原液（选定浓度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，1:256，1:512，每完成一个一稀释度必须更换吸头，每个稀释度溶液需要反复吹打