NY_T 554-2023 鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术.docxVIP

NY/T?５５４—２０２３ 鸭甲型病毒性肝炎１型和３型诊断技术 １　范围 本文件规定了鸭甲肝病毒１型和３型在鸭胚中的分离、RTＧPCR?鉴定、RTＧqPCR?鉴定;鸭甲肝病毒?１ 型的微量中和试验鉴定、抗体的微量中和试验检测和胚胎中和试验方法;鸭甲肝病毒３抗体的胚胎中和试 验方法. 本文件适用于鸭甲型病毒性肝炎１型和３型的诊断与检疫. ２　规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件. ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. ii rDHAV:鸭甲肝病毒(Duck?HepattsA? ii r DEF:鸭胚成纤维细胞?(DuckEmbryoFibroblasts) DEL:鸭胚肝细胞?(DuckEmbryoLiverCels) t???i sDEEC:鸭胚上皮细胞?(DuckEmbryoEpihel t???i s CPE:细胞病变?(CytopathicEfect) fea s t iiDMEM? fe a s t i i TCID５０:半数细胞培养感染量?(MedinTisueCulureInfectveDose) W/V:重量体积比?(Weght/Volume) i?i i iP iRTＧPCR:反转录 i?i i i P i PBS:磷酸盐缓冲液?(hosphateBuferSalne) i??i ＧiqRTＧqPCR:荧光定量 i??i Ｇiq ５　临床诊断 ５??１　临床症状 ５??１??１　该病主要发生于３周龄以内?的?雏?鸭,并?且?以?１?周?龄?内?的?雏?鸭?为?主.?感?染?鸭?发?病?急、传?播?快、病?死 率高. １５??１??２　发病初期,病鸭精神萎靡,食欲减退或废绝,眼半闭呈昏睡状,头?触?地;２h~２４h?后,病?鸭?出?现?神 １ 经症状,表现为运动失调、身体倒向一侧、两脚痉挛,死前头向背部扭?曲,两?腿?伸?直、向?后?张?开,呈?典?型?的?角 弓反张状. ５??１??３　最急性病鸭常未见任何异常而突然抽搐痉挛死亡. ５??２　病理变化 ５??２??１　大体病变主要?为?肝?脏?肿?大、质?地?易?脆,表?面?呈?黄?红?色?或?花?斑?状,并?有?特?征?性?的?点?状?出?血?或?刷?状 出血. ５??２??２　多数病例可见胆囊肿胀、胆汁充盈,部分病例脾脏肿大. ５??２??３　急性病例的组织学病变表现为肝细胞坏死、变性和淋巴细胞浸润,慢?性?病?例?或?耐?过?鸭?常?见?不?同?程 １ NY/T?５５４—２０２３ 度的空泡变性和淋巴细胞聚集. ５??３?　结果判定 凡具有５??１临床症状和５??２病理变化的病鸭,初步判定为疑似鸭病毒性肝炎. ６　病毒分离 ６??１　仪器设备 ６??１??１　冷冻台式离心机. ６??１??２　照蛋器. ６??１??３　恒温培养箱. ６??１??４　１?mL?注射器及针头. ６??１??５　手术剪. ６??１??６　镊子. ６??１??７　研钵. ６??２　耗材 ０??２２μm?细菌滤器. ６??３　试剂 ６??３??１　青霉素. ６??３??２　链霉素. ６??３??３　卡那霉素. ６??３??４　PBS溶液,按照附录?A?的规定配制. ６??３??５　５０％甘油生理盐水. ６??４　胚胎 １０日龄~１２日龄?DHAVＧ１或?DHAVＧ３抗体阴性鸭胚. ６??５　样品采集 ６??５??１　采集感染初期或发病急性期病鸭的肝脏. ６??５??２　送检病料置于灭菌的５０％甘油生理盐水中. ６??６　样品保存 ６??６??１　采集的样品若在４８h内处理,可于４?℃保存. ６??６??２　或尽快置于－２０?℃以下保存(－７０?℃储存最好). ６??７　样品处理 ６??７??１　组织样品于研钵中研磨后?加?入?５?倍?~１０?倍?pH?７??２~７??４?的?PBS?溶?液,制?成?组?织?悬?浮?液.?然?后 ３０００r/min４?℃离心３０?min,取上清液作为接种材料. ６??７??２　为防止细菌污染,可在样品液中加入青霉素１０００IU/mL、链霉素１０００μg/mL?和卡那霉素１０００ μg/mL,于３７?℃温箱中作用３０?min.或采用０??２２μm?细菌滤器对上述病料样品液作滤过除菌. ６??７??３　对处理的样品作无菌检验. ６??８　鸭胚接种 ６??８??１　取已处理并且无菌检验合格的样品,经尿囊腔接种?１０?日龄?~１２?日龄的非免疫鸭胚,每枚鸭胚?接 种０??２?mL?病毒液,每个样品接种４枚~５枚鸭胚.将已接种病毒的鸭胚置于３７?℃恒温培养箱中孵育. ６??８??２　弃去接种后２４h内死亡的鸭胚.对２４h内未死亡的鸭胚,每间隔６h观察胚胎的死亡情况.收 集２４h~９６h死亡鸭胚,放入４?℃