DB32-T 3762.11-2020新型冠状病毒检测技术规范 第11部分：全基因组测序.docxVIP

DB32/T 3762.11—2020 PAGE 8 新型冠状病毒检测技术规范 第11部分：全基因组高通量测序 范围 本部分规定了新型冠状病毒全基因组高通量测序的环境与设施、设备与耗材、试剂、样本前处理与核酸提取、全基因组测序、结果分析。 本部分适用于新型冠状病毒全基因组高通量测序。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构临床基因扩增管理办法 原卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原卫生部检验中心 国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求 原国家卫生计生委 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 全基因组测序 whole genome sequencing 对生物体整个基因组序列进行测定，以获得完整的基因组信息。 高通量测序 high-throughput sequencing 能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，又称“下一代”测序（next-generation sequencing）或深度测序（deep sequencing）技术。 Reads 高通量测序平台产生的序列称为reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位。 测序深度 sequencing depth 测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 测序覆盖度 sequencing coverage 测序得到的序列占整个基因组的比例。 环境与设施 实验室资质及级别要求 应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（BSL-2）进行，同时采用生物安全三级实验室（BSL-3）的个人防护；感染性材料或活病毒在采用可靠方法灭活后进行的核酸检测操作应在BSL-2进行。cDNA制备后的相关操作可在生物安全一级实验室（BSL-1）进行。全基因组测序实验室应符合GB 19489、《国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求》、《医疗机构临床基因扩增管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》相关要求。 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训并取得实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。样本制备及核酸提取防护参照DB32/T 3762.3的第4章进行，测序相关操作采用BSL-1的个人防护。 设备与耗材 设备 PCR扩增仪、核酸提取仪、核酸定量仪、高通量测序仪。 耗材 微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、96孔板磁力架、1.5 mL EP管、0.2 mL 8联排管、96孔PCR板。 试剂 核酸提取试剂盒、核酸定量试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、随机六聚体引物、经验证可靠的适合多重反应的PCR扩增试剂盒、DNA纯化磁珠、文库制备试剂盒、高通量测序试剂盒。 样本前处理与核酸提取 参照DB32/T 3762.3的第7章进行。 模板制备 cDNA制备 以提取的核酸为模板，采用第一链cDNA合成试剂盒和随机六聚体引物，根据试剂盒说明书在PCR扩增仪上制备第一链cDNA。 混合引物 将所有扩增引物（附录A）配置为100μM储存浓度，将49对Pool 1的引物各取5μL混匀，得490μL Pool 1引物池（引物总浓度为100μM），同样将49对Pool 2的引物各取5μL混匀，得490μL Pool 2引物池（引物总浓度为100μM）。 以去离子水分别将Pool 1和Pool 2引物池作10倍稀释，使其引物总浓度均为10μM，分装后储存以防止污染和降解。 多重PCR扩增 采用PCR扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置多重PCR扩增体系，反应体系中每一条引物的终浓度为0.015μM，Pool 1和Pool 2各配置一套扩增体系，每25μL反应体系中加入2μL cDNA模板。 按以下参数进行PCR扩增：98℃ 30s；98℃ 15s，65℃ 5min，扩增30循环；4℃ hold。 PCR产物的纯化 将每一份样本的Pool 1扩增产物和Pool 2扩增产物混合于新的8联排PCR管或96孔PCR板中。 采用DNA纯化磁珠法对混合后的扩增产物进行纯化，以30μL TE buffer (10 mM tris-HCl pH8.0, 0.1 mM EDTA)洗脱纯化后的产物。 DNA文库构建 纯化产物的定量与标化 使用核酸定量试剂盒对纯化产物进行双链DNA定量，根据所使用建库试剂盒说明对其进行标化。 DNA文库制备与混合 根据所使用的建