DB22T 2972-2019羊泰勒虫病病原检测 PCR法.docxVIP

吉林省市场监督管理厅 发 布 ICS 11.220 B 41 吉 林 省 地 DB22 方 标 准 DB 22/T 2972—2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR 法 PCR assay for detection of theileria ovis 2019 - 05 - 27 发布 2019 - 06 - 17 实施 I DB22/T 2972—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：延边大学、吉林农业科技学院、吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：贾立军、田万年、柴方红、梁晚枫、陈健、王海军、王欣睿、李国峰。 1 DB22/T 2972—2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了羊泰勒虫病病原PCR检测方法原理、试剂和仪器、样品采集、操作步骤和判定结果。 本标准适用于绵羊泰勒虫病病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链， 在DNA聚合酶的参与下， 根据碱基互补配对原则， 通 过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应 混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。 4 试剂和仪器 4.1 试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.1.1 血液 DNA 提取试剂盒。 4.1.2 10×PCR 缓冲液。 4.1.3 dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， 浓度 2.5 mmol/L。 4.1.4 Taq DNA 聚合酶，浓度 5 U/μL。 4.1.5 50×TAE 缓冲液见表 A.1。 4.1.6 10 mg/mL 溴化乙锭见表 A.2。 4.1.7 1%琼脂糖凝胶见表 A.3。 4.1.8 加样缓冲液见表 A.4。 4.1.9 阴性对照为健康绵羊血液 DNA 提取物。 4.1.10 阳性对照为羊泰勒虫感染的绵羊血液 DNA 或含有目的片段 DNA 序列， DNA 序列参见附录 B。 4.1.11 空白对照为灭菌双蒸水。 4.1.12 DNA Marker 分子量标准。 4.2 耗材 4.2.1 抗凝管。 4.2.2 吸头(200 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、2 μL~20 μL、0.5 μL~10 μL)。 2 DB22/T 2972—2019 4.2.3 Eppendorf 管(1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL)。 4.2.4 PCR 反应管。 4.2.5 三角瓶。 4.3 引物 引物序列与浓度见表 1。 表1 引物序列与浓度 引物 引物序列 长度/bp 基因序列 浓度/μmol/L P1(上游引物) 5-TGATGAGTTGATGTATTGTGGC-3 671 18S rRNA (AY262119) 10 P2(下游引物) 5-TACCCGCATCCTATTTAGCAG-3 4.4 仪器设备 4.4.1 微量加样器，单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1000 μL。 4.4.2 低温高速离心机，12 000 r/min 以上。 4.4.3 PCR 扩增仪， 温度范围为 4 ℃~100 ℃。 4.4.4 分析天平，感量 0.1 mg。 4.4.5 高压灭菌器，120 ℃ 以上。 4.4.6 微波炉或恒温水浴锅，室温~100 ℃。 4.4.7 水平电泳槽。 4.4.8 电泳仪，电压 1 V~300 V，电流 1 mA~400 mA。 4.4.9 凝胶成像系统或紫外灯。 5 样品采集 用抗凝管(4.2.1)无菌采集待检绵羊血液样品5 mL，编号。冷藏条件下送实验室检测。 6 操作步骤 6.1 样品 DNA 制备 按照血液DNA提取试剂盒(4.1.1)操作说明书，提取待检绵羊血液样品基因组DNA、 阴性对照(4.1.9) 样品基因组DNA和阳性对照(4.1.10)样品基因组DNA。 6.2 PCR 检测 在PCR反应管(4.2.4)中依次加入反应试剂，PCR扩增体系为25 μL，见表2。混匀后置PCR扩增仪 (4.4.3)中，反应条件为 96 ℃预变性5 min，