单细胞培养课件.pptVIP

Haberlandt：; ; 第5章 单细胞培养及突变体筛选 1 细胞培养 2 单细胞的分离 3 单细胞的培养方法 4 突变体的筛选;1.2细胞培养的意义：; 2 单细胞的分离; 2.1 由外植体直接分离 ⑴物理法： 叶片→捣碎→过滤、离心→收集细胞 ⑵酶解法：;2.2 由愈伤组织获得 ;将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物;2、单细胞培养方法：;;I 细胞密度：指单位体积内的细胞数量，是影响细胞培养的关键因子。 平板培养要求保证细胞密度为10 4 -10 5 个/ml 。 II平板培养的效果用植板率来衡量。 ; ;2）看护培养;;3）饲养培养（feeder layer culture）： 原理：平板法＋看护法 评价：单细胞和原生质体培养的理想方法。注：饲养层细胞没有种属特异性。;4）微室培养（microchamberculture) 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法。此法首先是由Jones等（1960）设计;优点：可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，形成细胞团的全部过程。 缺点：微室培养用的培养基量少，营养和水分就难以保持。pH值变动幅度大，培养的细胞仅能短期分裂。 ;2.2 单细胞培养的影响因子;成分 数量（mg·L-1） 成分 数量（mg·L-1） 成分 数量（mg·L-1）;（2）细胞密度直接决定细胞分裂与否： ①细胞分裂要求细胞密度达到一定水平； ②细胞会产生某些物质，并分泌到培养基中，只有当这些物质在培养基中达到一定的临界水平，细胞分裂才启动。 ;生长因子;3.2 获得突变体的方法 ⑴自发突变（体细胞无性系变异） 在组培过程中形成的再生植株表现出的遗传变异 特点：自发产生，无外在的选择压力；对于筛选目的突变体有一定的盲目性 适应材料：植物组培的培养物 ;⑵诱发突变 人为地采用物理和化学因素，诱发生物体产生遗传物质的突变，经分离、选择、培育成新品种的途径 方法：物理诱变、化学诱变 对象：种子、营养器官、离体培养材料（愈伤组织、单细胞、原生质体）;3.3 细胞突变体筛选的优点与意义（与整体植物相比） 培养细胞壁薄, 缺乏角质层和蜡质层，且处在不断分裂中， 比整体植物或种子更容易接受诱变； 细胞水平诱变周期短，缩短育种年限 ； 处理数目多，收率高； 避免了整株水平上常出现的嵌合体； 节省人力和物力进行选择，筛选效率高； ;3.4 细胞突变体筛选的技术路线： 选择起始材料，获得愈伤组织，制备单细胞悬浮系 人工诱变或自发突变 单细胞突变体 筛选有益突变体 单细胞培养，获得克隆 再分化 再生植株 突变株的鉴定 栽培 种苗表型： 抗除草剂、抗盐碱、抗病、 抗氨基酸等;（1）选择方法 ①直接选择：将培养细胞置于一定选择压力之下的选择方法。 选择抗性植株 eg：耐盐、抗除草剂、抗病、抗氨基酸突变体等 ;②间接选择：利用细胞内反应，形成某种有毒物质使野生型被淘汰，从而选出突变体 eg：硝酸还原酶突变株 在氯酸盐培养基上，具有硝酸还原酶活性的野生型细胞将被杀死，而突变株可以存活。 ;小麦耐盐细胞突变体筛选 1.小麦穗（花粉发育到单核晚期）射线辐照诱变。 2.取花药接种在N6+2,4-D2.0+KT0.5+NaCl0.3％上诱导愈伤组织。 3.在去盐培养基上，将上述愈伤组织继代1～3次。 4.移愈伤组织至N6+NAA1.0+KT1.0+NaCl0.3％上分化成苗。 5.将再生植株移栽到盐渍土中，检测其耐盐性。对耐盐好的植株以秋水仙素处理，使染色体加倍。 6.对入选株后代进行耐盐稳定性测定、遗传分析及育种应用。;（2）鉴定方法 ①形态鉴定