《分子生物药剂学》第11章 分子生物药剂学研究的新模型与新方法.pptxVIP

第十一章 分子生物药剂学研究的新模型与新方法24513细胞培养模型的应用生物物理实验技术的应用微透析技术的应用人工神经网络的应用疏水离子对的应用主要内容2431第一节 细胞培养模型的应用肠上皮细胞模型Caco-2细胞模型介绍Caco-2细胞模型评价及优缺点呼吸道上皮细胞模型一、肠上皮细胞模型肠上皮细胞（intestinal epithelial cells, IEC）是具有极性的柱状上皮细胞，参与肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等，黏膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子，是机体内最大的免疫组织。IEC是体内更新最快的一类细胞，对维持肠上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成为研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮的作用、细胞信号转导、肠道免疫等理想的体外模型。目前人体肠道上皮细胞模型的构建方法有两种，分别是transwell模型和gut-on-a-chip肠道器官模型。transwell模型由Borchardt和Workers 1989年提出，获得了美国FDA认证。从人肠肿瘤中分离出来的Caco-2细胞，通过在标准塑料培养皿或transwell插入物中培养这些细胞来研究体外肠道吸收和代谢。虽然这些培养物形成了分子运输的上皮单层屏障，但这些细胞呈现出非生理的鳞状上皮形态（并不是真实生理环境中的柱状突起），并不能重现人体肠道大多数的细胞分化及组织特异性特征。gut-on-a-chip肠道器官模型是由Hyunjungkim等在2012年创建，通过模拟人体肠道结构、运输吸收、生理病理属性以及关键微生物共生体，研制开发的仿生微型装置。该模型的缺点是细胞接种过程复杂，需要的时间长，培养过程中需要添加额外的机械装置（蠕动泵，真空控制器），很难规模化应用。肠道上皮细胞因其独特的优势，已被越来越多地应用于药物吸收机制的研究。肠道芯片由两条微流体通道组成，通道被涂有细胞外基质的多孔渗透柔性膜隔开，采用人肠道上皮细胞填满渗透性柔性膜，且通过施加循环应变模拟肠道生理蠕动运动，一个柱状上皮组织迅速向两级分化，自发地生长成折叠肠道绒毛结构，更加精确的模拟肠道复杂结构及生理变化。二、Caco-2细胞模型介绍Caco-2细胞是人类结肠癌细胞，在一定的实验条件下可以分化成与肠上皮细胞功能和形态相似的单层细胞。成熟时，Caco-2细胞在邻近细胞之间建立紧密的连接，使单层细胞具有与肠上皮相似的特征。该模型可用于药物高通量筛选、新药筛选，从细胞水平上考察肠吸收和转运情况，实验结果重现性良好。彭芳芳等利用Caco-2细胞模型研究枳实和麸炒枳实中黄酮类成分橙皮苷、新橙皮苷及其单体的双向跨膜转运特征，通过高效液相色谱法测定和分析枳实炮制前后橙皮苷、新橙皮苷经细胞转运后的含量变化，计算表观渗透系数（Papp），考察时间对二者吸收和转运的影响。邓改改等采用国际公认的可以模拟小肠上皮细胞的人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞单层模型，分别用6孔和12孔Transwell板，对禹白芷总香豆素及主要香豆素单体化合物进行了肠吸收转运对比研究，探索禹白芷中香豆素成分在香豆素单体给药及提取物给药情况下，吸收转运是否存在差异。为研究含有禹白芷的复方中药的禹白芷香豆素的肠吸收研究奠定了基础。三、Caco-2细胞模型评价及优缺点（一）Caco-2细胞模型评价手段Caco-2细胞模型可以通过以下指标进行评价：① 用碱性磷酸酶来评价细胞单分子层的酶；②光学显微镜和电镜检测细胞单分子层的表面和细胞间的 结构；③ 测定细胞单分子层的跨膜电阻；④ 细胞间转运标准物的渗透量。（二）Caco-2细胞模型的优点① Caco-2细胞虽然来源于人的结肠癌细胞，但在很多方面与人小肠上皮细胞是相似的，不会产生上皮细胞形态学和生理学性质上的种属差异，同源性好；② 与动物实验相比，Caco-2细胞生命力强，培养方法简单，培养细胞相对要比动物实验更省时经济；③ Caco-2细胞模型可同时对大批量药物进行快速筛选，所需药物量少，仅需数毫克即可；④ 受环境因素影响小，实验条件可精确控制，与动物实验相比较个体差异小；⑤ 培养成熟的Caco-2细胞是致密的单层细胞，具有与正常的小肠上皮细胞相同的极性，可以从不同方向进行摄取和转运实验，可用于区分肠腔内吸收的差异；⑥ 无正常成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现的反分化情况；⑦ Caco-2细胞含有与刷状缘上皮细胞相关的酶系能够检测药物的代谢稳定性，在代谢情况下测定药物的跨膜转运；⑧ Caco-2细胞含有大量转运蛋白的表达，可以用来研究包含蛋白的转运机制；⑨ Caco-2细胞可以观察药物对黏膜的毒性作用。（三）Caco-2细胞模型的缺点① 缺少产生粘蛋白的细胞，缺少肠壁的黏液层。② 缺少细胞异质性；③ 具有较高的细胞通透性、喂养次数多、某些酶载体或细胞内容物溢出等；④