「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点.docx

「试验笔记」流式细胞术试验过程中的操作要点 流式细胞术可以同时分析单个细胞的多个参数。目前广泛应用于细胞外表和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分别出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量等方面，在流式流式细胞术试验过程中，以下操作要点肯定要留意，避开影响试验结果。 1、上机前处理 留神荧光淬灭 操作时必需严格依据孵育时间，假设抗体孵育时间过长，荧光是会渐渐淬灭的。那假设不得不推迟试验怎么办?可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。 留意染色挨次 在进展多荧光染色的时候，一样的细胞会由于染色挨次不同而导致荧光强度的差异。解决方法为：预试验。做一系列的不同染色挨次的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进展比较分析，推断染色挨次对细胞造成的影响。 选好染色方案 染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预试验。在正式开头试验之前，通过预试验，设计出一个完善的染色方案。(考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。) 做好阴性比照及同型比照试验 细胞阴性比照可以显示细胞基准的荧光水平。 同型比照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型比照需要留意承受一样物种、一样亚类、一样染料、一样浓度，否则，检测的时候会消灭乱七八糟的同型比照结果。 选择适宜的抗体 通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。依据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色试验，需选择放射光谱重叠小的染料。 2、参数设定 数据的猎取必需是在仪器性能的校准均合格的根底上进展。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。 电压 电压的调整需依据阴性比照管来调整。 阈值 可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值;大多数样本都可以设定 FSC/SSC; 阈值以下的信号不存储;可以依据阴性比照管来调整。 目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。 补偿 流式细胞分析中常常要用到 2 种以上的荧光标记抗体进展染色，而目前所使用的 多种荧光染料放射谱间有肯定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。 补偿方式：任意两个通道之间都可以调整。补偿的调整：依据单染比照管来调整。