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药物分析知识讲义;药物分析;第五章;体内药物分析;掌握: 体内药物分析的特点和应用体内样品分析的前处理 体内样品分析方法验证的内容 熟悉: 体内样品的采集与制备方法 体内样品分析方法验证的技术要求 了解: 体内药物分析的性质与意义;体内药物分析的特点和应用;体内药物分析;体内样品的特点 采样量少: ml~μl级;且不易重新获得 待测物浓度低:μg/ml ~ng/ml级, 甚至pg/ml 干扰物质多: 尤其是血样和组织中的蛋白质;常用体内样品的制备与贮藏;体内样品的种类;1. 血样的采集;(一) 冷藏与冷冻;体内样品分析的前处理;仪器污染,劣化(去蛋白)提高测定灵敏度/选择性化学改性(衍生化);(一) 去除蛋白质法;加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→ 药物释放;液相萃取法 固相萃取法 超滤法;溶剂的选择原则;①对药物分子未电离形式可溶, 对电离形式不溶； ②沸点低,易挥发;;有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1;固相萃取法的原理;含药物体内样品通过小柱时, 受到 “吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力 作用, 药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料) 洗脱方式有两种: ①冲洗溶剂洗去干扰物, 再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物; ②药物直接被洗脱, 干扰物保留;第1步: 甲醇润湿小柱, 活化填料; 净化填料 第2步: 水/缓冲液冲洗小柱, 去除甲醇; 甲醇含量过低(低于5%)致C18链弯曲折叠, 回收率降低;① 样品(血浆)通过萃取柱的流速在 1-2ml/min; ② 冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失/选择性下降, 通常选用可与水混溶的洗脱剂; ③ 萃取碱性药物时, 洗脱剂中常加酸,有机胺, 氨水, 醋酸铵或离子对试剂;2023-07-08;对于单个样品处理, SPE操作省时对于大量样品的处理 半自动SPE: 萃取过程机械化 全自动化仪器: 通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用;柱切换: 固相萃取-LC/MS/MS;((44)) 提提取取操操作作;简便, 快速水解过程中 发生药物分解专一性较差;1. 在GC中的应用 硅烷化: 三甲基硅烷(TMCS) 酰化: 三氟乙酸酐(TFAA);体内样品分析方法与方法验证;(一) 分析方法的选择;HPLC, GC HPLC-MSn, GC-MS;待测物,内标(必要时)的标准物质色谱柱(填料),流动相,溶剂,进样;(一) 特异性 (二) 标准曲线与定量??围 (三) 定量下限;(七) 分析过程的质量控制 (八) 未知样品浓度超限的处理 (九) 药用内源性物质的测定;比较标准物质与6个不同个体的空白生物介质和QC样品 软电离质谱 (LC-MS)介质 效应;少数方法(如,IA)外, 通常为线性模式 线性回归: 最小二乘法或加权最小二乘法;2. 限度要求;定量下限(LLOQ): 标准曲线上的最低浓度点符合准确度和精密度要求;方法精密度除评价批内(日内)RSD外, 同时还应评价批间(日间)RSD;短期稳定性: 在1个分析批内,样品室温等待处理; 处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性 长期稳定性: 在整个样品分析期间, 体内样品的长期储藏, 冻融;以及标准储备液的稳定性;1. 测定法 高中低3个浓度的QC样品, 制备至少5个独立的样品 另取空白生物介质,照QC样品同法处理,加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂) 同法处理高中低3个浓度的标准对照样品(不含生物介质);每个未知样品测定一次, 必要时进行复测 来自同一个体的体内样品在同一分析批中测定 每个分析批, 建立批标准曲线; 并随行3浓度QC样品 QC样品每个浓度至少双样本, 并均匀分布在未知样品顺序(低→高/高→低顺序均匀穿插整个分析批)中 一个分析批内未知样品数目较多时, 应同时增加各浓度QC样品数, 使QC样品数大于未知样品总数的5% QC样品测定结果的偏差不大于±15%, 低浓度点偏差不大于±20%; 允许1/3非同浓度QC样品结果超限 不符合上述要求, 则该分析批样品测试结果作废;理;测定;的验证; 标准物质(reference standard): 用于制备标准样品和 QC样品的待测物的参比标准 在结构上可以是待测物本身, 也可以是其游离碱或酸, 盐或酯 常用的标准物质主要有三种来源: ①法定标准物质 (如ChP标准品或对照品,USP标准品); ②市售标准物质(来自于具有良好信誉的供应商); 或③分析实验室或科研机构自行合成和/或纯化的具有一定纯度的化合物 生物介质(biological matrix): 生物来源的物质, 能以可; 介质效应(matrix effect): 样品中存在除待测物以外的其他干扰物质对响应造成的直接或间接的影响 标准样品(standard sle): 在