高中生物：单克隆抗体制备详解.docx

单克隆抗体制备详解 1、抗原制备 用于制备单克隆抗体的抗原纯度越高，单抗制备实验的成功率越高。一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。 2、免疫动物 2.1免疫动物的选择 通常，根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠或大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于 LOU/c 大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。就小鼠而言，一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠。 2.2制定免疫方案 设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、 免疫次数与间隔时间等。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射等。免疫次数一般是3次（链接高中知识：多次注射疫苗的意义？）。间隔时间因抗原不同而不同，间隔1天到1月不等。动物的免疫一般在融合前前两个月，根据确定的免疫方案开始对动物进行初次免疫。动物的免疫通常共有三次，一般来说，在最后一次加强免疫后第 3 天取脾（链接高中知识：免疫器官）进行融合较适宜。由不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此在注射抗原的同时，常常会加入佐剂，以增强抗原的抗原性，刺激机体产生较强的免疫反应。 3、制备杂交瘤细胞前的准备工作 3.1准备 脾淋巴细胞 已经免疫的 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠），在无菌条件下去除脾脏，并完成脾淋巴细胞的制备。 注1：如何制备单细胞悬液，以备后面的细胞融合？（链接高中知识：细胞悬液制备） 注意：制备脾淋巴细胞过程中，通常也会进行小鼠眼球摘除采血的的操作，将血清分离后作为抗体检测时阳性对照血清（链接高中知识：实验设计对照思想）。 3.2 准备 骨髓瘤细胞制备（略） 3.3 准备饲养细胞（链接高中知识：克隆培养法） 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它细胞，则可使这些细胞生长繁殖，这种加入的细胞称为饲养细胞。在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入饲养细胞使之繁殖。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞，高中教材中用的是小鼠成纤维细胞。 4、 细胞融合及筛选 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG 处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，会产生多种融合结果：未融合的骨髓瘤细胞、未融合的 B 淋巴细胞、B 淋巴细胞自身融合细胞、骨髓瘤细胞自身融合细胞、正确融合的杂交瘤细胞。 为了得到所需的杂交瘤细胞，必须利用 HAT 培养基对融合后的细胞进行筛选。HAT 培养基的筛选原理为：DNA合成途径有生物合成途径与应急合成途径两种，HAT 培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A） 和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质，氨基喋呤可以对 DNA 的生物合成途径进行阻断，骨髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而 B 淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在 10 天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA 并在 HAT 培养基中正常生长，不会死亡。因此将融合后的细胞放于 HAT 培养基中培养，其他的融合结果会 全部死亡，最终筛选出杂交瘤细胞 5、杂交瘤细胞的克隆化 所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行 2-3 次克隆化，有时还需进行多次。原因（1）从原始孔中（下图2细胞培养板中的培养孔）得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化；原因（2）杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已经不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系，也需要克隆化； 原因3长期液氮冻存的杂交瘤细胞（见下图），复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。 6、大规模获得单克隆抗体 6.1 体外培养 6.2 体内培养 7、 杂交瘤技术优缺点 优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。 缺点：a.操作步骤繁琐；b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体( HAMA）反应、在人体循环系统中很快被清除等。（避免缺点，研制嵌合体抗体