广州地区产imp-9金属酶铜绿假单胞菌的同源性分析.docxVIP

广州地区产imp-9金属酶铜绿假单胞菌的同源性分析 铜绿假单胞菌是医院感染的重要病原体。它可以在医院环境中长期存在。特别是如果身体阻力降低或免疫功能受损，相关的医院感染可能会持续。由于存在多种耐药机制, 临床表现为多重耐药性。 2005~2007年广州地区多家医院曾出现产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行 有该流行株的存在, 我们收集了2007年10月到2008年11月广州地区7家医院出现的对所有常见抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌泛耐株 (PDR) 共269株, 从中筛选出产IMP-9金属酶的菌株, 并以2005年爆发克隆株作参考, 了解产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的分子同源性。 1 材料和方法 1.1 菌株鉴定及鉴定 菌株收集2007年10月至2008年11月广州地区7家大型医院所保留的铜绿假单胞菌多重耐药株共269株。阳性对照株为2005年出现爆发流行的产IMP-9克隆株2376。铜绿假单胞菌ATCC27853为阴性对照株。菌种鉴定采用VITEK2系统 (Biomerieux, 法国) 。 主要仪器和试剂Lambda Ladder PFG Marker购自美国NEB公司、PCR引物和序列分析均由上海英俊生物技术有限公司合成和检测、梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司、GEL-DOC XR凝胶成像系统购自美国Bio Rad公司。 1.2 制备菌体模板 DNA的抽提 (1) 取大约0.2ml培养物加入离心管中, 6000r/min离心2min沉淀菌体; (2) 尽量将所有上清吸去, 加入200μl的无菌水, 混匀菌体; (3) 100℃煮沸10min, 置4℃10min, 8000r/min离心10min, 弃沉淀, 上清液为模板。 采用PCR方法筛查目标菌株的bla P C R产物测序P C R产物经纯化后送上海英俊生物技术有限公司进行测序, 测序结果采用Gene Bank中的BLAST程序进行对比分析。 ERIC-PCR分子流行病学分型 患者临床资料分析回顾性分析了10例携带IMP-9金属酶铜绿假单胞菌患者的病例资料, 了解其基本情况、诊疗经过、细菌学检查等。 2 结果 2.1 imp阳性对照株的鉴定 菌株985, 3798, 1401, 1245, 1380, 447, 2949, 4530, 4555, 3768和IMP-9阳性对照株2376在约490bp处出现相同的条带 (见图1) , 通过对985, 3798号菌株的IMP-9基因PCR阳性产物进行正向测序, 经Clustal W程序分析, 其核酸序列与Gen Bank已登陆的bla 2.2 不同基因型的a、b、c型的分子身份证 菌株1245, 1380, 1401, 3798为A1型, 985为A2, 3768, 4555, 4530为A3, 447为A4型, 2949为A5型, 均为A克隆, 为同一基因型, 阳性对照株2376为B型, A, B型之间的相似度低于80%, 故分属不同克隆 (图2) 。 2.3 机械通气和纤支镜检查 10株IMP-9金属酶铜绿假单胞菌均来自同一家医院A医院的痰标本, 其中来自于ICU病房4株, 呼吸内科普通病房4株, 胸外科2株, 其中来自ICU的患者均为有接受机械通气和纤支镜检查的病史, 其余6位都曾接受过纤支镜检查。编号447, 2949, 3768, 3798共4位患者在2005年至2007年初即广州地区多家医院出现产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行期, 曾分别入住过A院呼吸内科, 住院时间均在3个月以上, 在上述住院期间均接受过机械通气或纤支镜检查, 并且在痰标本中曾经分离出铜绿假单胞菌。所有10位患者都存在1种或1种以上严重的基础疾病:重症肺炎、慢性阻塞性肺气肿、肿瘤化疗或放疗后和肺移植术后等 (表1) 。 3 携带imp-9克隆株的临床分型 2005年3月至2007年3月期间, 我们曾对广州地区4家大型医院进行铜绿假单胞菌泛耐株的同源性检测, 结果发现产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌克隆株的爆发流行, 并且该克隆株主要集中在A医院 从本次调查的结果发现, IMP-9克隆株仍然存在, 且仍然集中于A医院, 但与前期发现的爆发流行阳性对照株2376分属不同克隆。本次发现的携带IMP-9克隆株的10位患者, 有4位曾在2005年3月至2007年3月, 即IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行期间入住过A医院, 住院时间从3个月到半年不等, 而其余6位患者均在2007年11月后首次入住A院。所有10位患者, 住院期间均接受过至少一次机械通气或纤支镜等的侵入性器械检查。4位曾入院患者在IMP-9克隆株爆发流行期间也曾分离出泛耐的铜绿假单胞菌, 且其耐药表型和本次分离株基本相同, 对碳青霉烯类, 第三代头孢菌素类, 氨