核酸的生物合成课件.PPTVIP

半不连续复制的特点：新DNA的一条链是按5‘→3’方向（与复制叉移动的方向一致）连续合成的，称为“前导链”；另一条链的合成是不连续的，先按5‘→3’方向合成若干短片段（冈崎片段），再通过酶的作用将这些短片段连在一起构成第二条子链，称为“后随链”。 4、DNA复制的分子机制（基本过程） ①起始阶段：形成DNA模板—RNA引物—DNA聚合酶三元复合物。 除连接酶外其他各类酶都起作用。 ②延长阶段：一个复制叉，可以合成一个“前导链” （连续合成的）和一个“后随链”（是不连续合成的，经连接酶的作用形成。）。 ③终止阶段：是DNA合成的终止和两个子代DNA分开的过程。 (四)真核生物DNA的复制 1、真核生物的DNA聚合酶：目前发现有五种，分别命名为DNA聚合酶α（pol α），DNA聚合酶β（pol β），DNA聚合酶γ（pol γ），DNA聚合酶δ（pol δ），DNA聚合酶ε（pol ε）。 2、真核生物端粒的形成： ①端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。 ②线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 三、基因工程 内切酶——DNA分子的“手术刀” 连接酶——DNA片段的“缝衣针” 载 体——DNA转移的“交通工具” 核心技术：DNA重组技术 基因重组技术 四、多聚酶链式反应（PCR）技术 五、cDNA文库的构建 （一）cDNA文库（library） cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。 为了得到特定基因的cDNA片段，就需要先分离出有功能的特定mRNA。所以首先必须考虑从什么细胞，用什么方法将ｍＲＮＡ提取出来。这是由于不同细胞可限定合成不同的蛋白质，这样在一些组织细胞中除了含有普通蛋白质的mRNA外，还会有数量较多的特定mRNA。 （二）mRNA的分离 mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。有的还可以利用真核生物的mRNA具有的poly A尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。  （三）构建cDNA文库 在取得专性的mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库。 第二节 RNA的生物合成 一、不对称转录 基因（有义链） 3’ mRNA 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 反义链 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。 经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。 二、RNA聚合酶： 这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5→3聚合RNA。 大肠杆菌RNA聚合酶全酶形式：α2ββ/σ α2ββ/称核心酶，有活力。 σ因子：辨认模板DNA链上的起始位点。 真核生物中的RNA聚合酶可按其对α-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由10～12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。 三、转录过程（原核生物） 1、形成“全酶—DNA”复合物 RNA聚合酶 α2ββ/σ中的σ因子专门辨认模板DNA链上的起始位点，使全酶结合在起始位点上，形成“全酶—DNA”复合物。 2、转录的起始 加入4种NTP，在全酶的作用下，开始起始反应，产生第一个核苷酸间磷酸二酯