Peters异常PITX2及PAX6基因型表型分析.docxVIP

? ? Peters异常PITX2及PAX6基因型表型分析 ? ? 孟 永，卢国华，谢 阳，孙新成，黄丽琴 0引言 Peters异常(Peters’ anomaly，PA)是较少见的眼前段发育不良性眼病，1906年由Peters首先报道，临床表现为先天性的角膜中央区混浊，对应区域的角膜后基质层变薄和后弹力层缺损、虹膜角膜粘连等[1]。该病在新生儿中的发病率国外报道为1.2/100000，绝大部分病例为散发，但也有一些常染色体显性及隐性遗传的报道[2-3]。Peters异常分型：按照文献描述的方法可将Peters异常分为Ⅰ型和Ⅱ型，仅有角膜混浊、虹膜前粘连而无晶状体异常者为I型，同时合并白内障或存在晶状体与角膜内皮粘连者为Ⅱ型，如果还伴有神经起源的全身异常则诊断为Peters综合征。临床中Peters异常患者可合并有其它眼部非特征性异常如巩膜化角膜、牵牛花综合征、Axenfeld-Rieger综合征(Axenfeld-Rieger syndrome，ARS)、永存原始玻璃体增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)等[4-5]。目前国外有Peters异常相关致病基因PITX2、PAX6等的分子遗传学的研究；而国内Peters异常PITX2和PAX6基因的报道很少[6-7]。PITX2是Paired-Bicoied同型盒蛋白家族成员,剪切翻译形成271aa，317aa，324aa三种亚型，这三种亚型同源结构域以及羧基端的序列相同，而氨基端不同，第60位的氨基酸同源结构域2(homeobox-2)可通过其内在的“螺旋-旋转-螺旋”(helix-turn-helix，HTH)结构与特异性DNA位点相结合，在发育中起着重大作用，第50位同源结构域氨基酸赖氨酸对于特异性结合DNA具有决定性作用；PAX6是眼球发育的主控基因之一，其编码产物是结合蛋白家族之一,其中的配对盒结构域和同源结构域作为高度保守的转录因子，可通过结合特定序列在视网膜、晶状体和角膜中广泛表达。在中国人群中进行该项研究，既可以了解中国人群Peters异常患者中PITX2和PAX6基因的突变情况，分析中国人群中Peters异常基因型表型的关系，为进一步研究其发病机制提供线索。 1对象和方法 1.1对象对2016-01-01/2019-03-30于常州市第二人民医院和第三人民医院就诊的15例Peters异常患者的临床资料进行分析，详细询问病史和家族史并进行PITX2和PAX6基因筛查；对发现的突变患者其家系成员均完善眼科检查，并排除全身的异常，收集临床的资料。80例正常对照者均无眼或全身遗传性疾病，和患者无任何血缘关系。遵循相关伦理原则,征得患者及所有成员的同意后抽血制备基因组DNA,并收集相关临床资料。 1.2方法 1.2.1聚合酶链反应(PCR)扩增采集Peters异常患者和所有成员外周血DNA，引物序列及扩增条件见本文作者之前发表Peters异常一文[6]。 图1正常对照者及突变患者测序图A：正常对照者；B：突变患者。 图2异源双链-单链构象多态性分析结果+：突变患者。 1.2.2突变基因筛查PCR产物纯化以后，加入BigDye双向测序反应，使用AB13730分析仪双向测序，测序发现的PITX2和PAX6新突变结果与NCBI数据库中PITX2及PAX6的序列进行比对，确定突变位点。根据人类基因组变异协会(HGVS，/)命名法对PITX2和PAX6突变进行命名。 1.2.3测序结果分析将碱基变异的测序结果输入DNAStar公司的MapDraw程序进行遗传信息改变的确定，NCBI上人类基因组数据库中,PITX2及PAX6两个基因的DNA序列作为标准序列，以识别碱基变异对氨基酸编码产生的影响。 1.2.4异源双链-单链构象多态性分析用异源双链-单链构象多态性(HA-SSCP)的方法对突变患者及其父母及80例正常对照进行对比验证。 2结果 对15例Peters异常患者PITX2和PAX6基因的外显子及邻近的内含子区域进行直接测序，15例Peters异常患者PAX6基因未能发现任何突变，患者中检测到1个已报道PITX2缺失突变c.296delG(P.R99fsx56)，正常对照者及突变患者测序图对照(图1)。分析其详细临床资料，这是中国首次报道伴有ARS的Peters异常眼病PITX2基因突变。 2.1基因突变筛查Peters异常1例及ARS合并症患者中发现一PITX2基因突变，该突变为缺失突变，位于PITX2A的第五外显子内，编码区第296位的碱基G缺失，该碱基缺失的后果会导致羧基端读码框架的移位，使编码的第98位氨基酸和原蛋白发生偏离，并且移位的读码框架在编码第153个氨基酸后产生了一个提前的终止密码子，致使理