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昆虫激素对家蚕血淋巴和体壁中酚氧化酶活性及其基因表达的影响 0 其他生物酶 酚类氧化是一种复杂的酶，可以将酚类氧化为相邻的苯基或苯基。它广泛分布于动植物世界，对生物的产生了非常重要的生理作用。 1 材料和方法 1.1 h暗新鲜白砂糖饲育 供试家蚕品种为大造，恒温培养箱26℃，相对湿度（75±5）%，光照周期（12 h光∶12 h暗），新鲜桑叶饲育。蜕皮激素20E(Y0002054）和保幼激素（JH）类似物（33375）购自Sigma公司，动物组织总RNA抽提试剂盒（ER501-01）购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒（RR047A）购自Ta Ka Ra公司，荧光定量试剂Hieff 1.2 激素处理和样品采集 激素处理操作参照 1.3 待测酶液的制备 (1）酶液制备：家蚕体壁先用PBS清洗干净，再以液氮充分研磨，加入适量的10 mmol/L Tris-HCL(p H 7.0），在4℃下10000 r/min离心10 min，上清液即为待测酶液。血淋巴直接在4℃下10000 r/min离心10 min，上清液即为待测酶液。（2）酶活性测定：按照酚氧化酶测试盒说明测定家蚕血淋巴和体壁酚氧化酶活性。 1.4 总ra提取和反编码 根据动物组织总RNA抽提试剂盒操作说明提取家蚕血淋巴和体壁总RNA，以分光光度计测定OD 1.5 实时荧光定量pcr检测 以家蚕酚氧化酶原基因PPO1(Gen Bank登录号BAA08368）和PPO2(Gen Bank登录号BAA08369）为靶基因、RP49基因（Gen Bank登录号NM＿001098282）为内参基因，利用Primer Premier 5.0设计实时荧光定量PCR引物（表1），并委托深圳华大基因科技有限公司合成。 参照荧光定量试剂Hieff 2 结果与分析 2.1 jh对家蚕血淋巴和ppo1表达的影响 实时荧光定量PCR检测JH处理后家蚕血淋巴和体壁酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达情况，结果如图1和图2所示。由图1可看出，家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因均在JH处理6和12 h后呈上调表达趋势，且相对表达量明显高于相应的对照组。其中，PPO1基因在JH处理6 h后出现表达高峰，与对照组间的差异达极显著水平（P0.01，下同），至处理12 h时其相对表达量虽有小幅度下调，但仍极显著高于对照组；PPO2基因则在JH处理12 h后出现表达高峰。与相应的对照组相比，PPO1基因的相对表达量在JH处理6和12 h时分别上调2.8和2.3倍，而PPO2基因分别上调1.7和1.9倍，说明家蚕血淋巴PPO1基因对JH的响应更敏感。 由图2可看出，注射外源JH能有效抑制家蚕体壁酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的相对表达量。经JH处理3 h后，家蚕体壁PPO1和PPO2基因均开始显著下调表达（P0.05，下同），且随处理时间的延长，其相对表达量持续降低；至JH处理12 h时家蚕体壁酚氧化酶原基因的相对表达量降至最低值，与相应的对照组相比，其差异均达极显著水平；处理24 h后由于JH可能逐渐被消耗代谢，PPO1和PPO2基因相对表达量得到一定程度的恢复。 2.22 e对家蚕血淋巴酚氧化酶原基因表达的影响 由图3可看出，注射外源20E后家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因的相对表达量均高于对照组，整体上呈先显著上调再缓慢下调表达趋势。PPO1和PPO2基因相对表达量均在20E处理3 h开始显著上调表达，至处理6 h时其相对表达量达峰值；随后家蚕血淋巴酚氧化酶原基因相对表达量开始下调，但至处理12 h时其相对表达量仍显著高于对照组；20E处理24 h后家蚕血淋巴酚氧化酶原基因的相对表达量略高于对照组，但差异不显著（P0.05，下同）。由图4可看出，家蚕体壁PPO1基因在20E处理6和12 h呈上调表达趋势，与对照组的差异达极显著水平；注射外源20E后家蚕体壁PPO2基因的相对表达量无明显变化，表明体壁PPO2基因对外源20E无应答。 2.3 酚氧化酶活性变化 注射外源JH和20E后，家蚕血淋巴和体壁酚氧化酶活性变化趋势如图5和图6所示。由图5可看出，经JH处理3 h后家蚕血淋巴酚氧化酶活性与对照组间无显著差异，但至处理6 h时急剧升高至峰值，极显著高于对照组；处理12 h后酚氧化酶活性有所下降但仍显著高于对照组，至处理24 h时降至对照组水平。经20E处理后，家蚕血淋巴酚氧化酶活性在处理3 h后略高于对照组，但无显著差异，从处理6 h开始逐渐升高，至处理12 h时酚氧化酶活性达峰值，与对照组的差异达极显著水平，但在处理24 h后酚氧化酶活性又恢复至对照组水平。由图6可看出，家蚕体壁酚氧化酶活性在JH处理6和12 h后显著低于对照组，而经20E处理6和12 h后显著高于对照组，说明JH和20E对家蚕体