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固相微萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的糖皮质激素 糖皮质激素是肾上腺分泌的一种类固醇激素。它具有抗炎、抗过敏、抗休克和抗抗菌抗抑制等作用。它也可以用作动物生长促进剂，加速动物生长，并广泛应用于动物和牲畜的生产中。 糖皮质激素的检测方法主要包括气相色谱-质谱法（GC) 中空纤维微萃取（HF-SPME）是一种利用中空纤维的微孔孔径较小限制样品溶液中的大分子物质进入萃取相，集萃取和净化一步完成的样品预处理技术。在环境、生物样品痕量分析中有良好使用 氧化石墨烯是近年来兴起的一种新型纳米材料，具有超大的比表面积及丰富的含氧官能团，可与有机化合物形成π-π相互作用，被广泛应用于样品的前处理研究 该方法采用中空纤维/氧化石墨烯用于样品前处理，并与高效液相色谱-串联质谱法相结合建立同时测定牛奶中7种糖皮质激素的分析方法。该方法简单高效，同时灵敏度也能满足日常检测需求，适合于实验室大批量检测。 1 材料和方法 1.1 可的松、加氢的松 糖皮质激素标准品：倍氯米松、地塞米松、甲基泼尼松龙、氟氢可的松、氢化可的松、可的松、泼尼松龙（德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95%）；氘代氢化可的松内标物（加拿大CDN公司，纯度≥99%）。 氧化石墨烯（实验室自制 1.2 仪器、仪器和仪器 三重四级杆液相色谱/串联质谱仪（LC-MS 8050，日本Shimadzu公司）；多管涡旋混合仪（DMT-2500，杭州米欧仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；超纯水机（美国Millipore公司）。 1.3 方法 1.3.1 氧化石墨烯溶液的制备 将中空纤维膜剪成长度约2 cm小段，用丙酮超声清洗10 min，取出晾干。取50 mg氧化石墨烯分散于100 mL N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散2 h，制备成500 mg/L氧化石墨烯溶液。将晾干的中空纤维浸入500mg/L氧化石墨烯溶液中超声2 h，使氧化石墨烯完全固定在中空纤维膜的微孔中，取出用去离子水洗涤数次，除去中空纤维表面及内部多余的氧化石墨烯，晾干备用。 1.3.2 标准贮备液 准确称取适量的标准品，用甲醇分别配制成100mg/L的标准贮备液，置于-18℃冰箱保存。使用时，用甲醇稀释成各种浓度的混合标准工作液和内标工作液，备用。 1.3.3 氧化石墨烯/中空纤维的制备 称取5 g样品于10 mL离心管中，加入50μL 500μg/L氘代氢化可的松同位素工作液，用0.1 mol/L的NaOH溶液调至pH 10，将处理好的氧化石墨烯/中空纤维放入离心管中，超声萃取10 min。取出氧化石墨烯/中空纤维，滤纸擦干后放入装有1 mL甲醇的小瓶中，超声解析3 min，经0.22μm滤膜过滤后待测。 1.3.4 仪器条件 1.3.4. 流动相a/b分离 ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8μm）；进样量3μL；柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸-2 mmol/L水溶液，B为乙腈溶液；流速0.15 mL/min；采用梯度洗脱的分离程序，洗脱程序：0～0.5min,10%B;0.5～1.5 min,10%～40%B;1.5～2.5 min,40%～90%B;2.5～5 min,90%B;4～5 min,65%～90%B;5～6 min,90%～10%B。 1.3.4. 运行电压 电喷雾离子源（ESI）：负离子模式；加热块温度400℃，毛细管电压4 000 V；雾化气流量3.0 L/min；加热气流量10.0 L/min；定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表1。 2 结果与分析 2.1 萃取条件优化 2.1.1 萃取效率的影响 由于糖皮质激素类药物在牛奶中以痕量存在，加大样品的称样量，增加富集倍数，是提高实际检测浓度的有效手段之一。考察样品1～10 g时对萃取效率的影响。结果表明（见图1），样品量增加到5 g时，萃取效率没有明显变化，继续增加样品量，萃取效率逐渐减少。这可能是样品量5 g时刚好达到吸附平衡，样品量继续增大，仅用2 cm的氧化石墨烯/中空纤维和10min的萃取时间无法充分吸附目标化合物，致使萃取效率降低。因此，选择样品量为5 g。 2.1.2 萃取效率的测定 样品溶液pH不仅能改变目标化合物的存在形态，也会改变吸附材料表面电荷和密度，是影响萃取效率的重要因素。考察pH 4～14的萃取效率。结果表明（见图2),pH 4～10时，随着pH增加，萃取效率明显增大。这是由于目标化合物为碱性化合物，在碱性环境中呈分子状态，随着pH增大，与氧化石墨烯之间的疏水作用力增强，萃取效率增大；之后随着pH增大，萃取效率略有下降，这可能是氧化石墨烯絮凝沉淀的关系。因此，试验选择最佳pH 10。 2.1.3 萃取时间的影响 试验比较超声