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基于issr标记构建苏杭菜和利川菜的分子身份证 流行花是大量水生植物和重要水生作物，属于水生百合科或水煮草科。 莼菜很早就被奉为珍贵食品, 其主要食用部分是富含胶质而未展开的幼嫩卷叶, 含有丰富的多糖、蛋白质、维生素和微量元素, 并具有很高的药用价值 近年来国内外有关莼菜的研究主要涉及莼菜栽培、食用和药用价值 1 材料和方法 1.1 幼嫩叶片的采集 莼菜植株材料采自6个不同地区, 分别为华中地区的利川忠路 (LCZ) 、利川福宝山 (LCF) 和利川白河岭 (LCY) , 华东地区的杭州西湖大清谷 (SDS) 、杭州周浦 (HZC) 和苏州东山 (HZD) 。在莼菜开花期间, 共采集上述6个不同地方的46株莼菜的新鲜幼嫩叶片, 每株5~10g (表1) 。对于自然居群采集的样本数目较多, 而人工种植居群仅少量采样 (如利川白河岭等) , 因此, 取样数目差别较大 (2~15) 。由于莼菜主要营克隆 (无性) 繁殖, 而且其地下茎在水中为丛生状、多分枝, 因而采样时尽量间隔一定距离取样, 以避免相邻的取样其实为同一株莼菜。将每份幼嫩叶样本置于装有硅胶的密封袋中迅速干燥, 备用。采用CTAB法提取上述不同品种的莼菜幼叶的基因组DNA 1.2 pcr扩增和品种鉴定引物的筛选 从购自上海生工生物工程公司的60个ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、重复性较好的6条引物用于PCR扩增和品种的鉴定。这6条引物分别是P810、P817、P825、P834、P845和P848, 其序列见表2。扩增反应在PTC-100 1.3 同一迁移方向上有条带共条带 ISSR-PCR扩增产物按条带的有无分别进行0、1数据处理, 在相同迁移位置上有条带的 (包括弱带) 记为“1”, 无条带的记为“0”。采用POPGNEN version 1.32版软件 1.4 不同品种ssr指纹图谱的构建 以其中能够稳定产生华东苏杭和华中利川莼菜特异带型的3条ISSR引物 (P825、P845、P817) 作为鉴别不同品种的核心引物, 形成莼菜品种资源的ISSR指纹图谱, 构建鉴别苏杭莼菜品种和利川莼菜品种的特异的分子身份证模式。 2 结果与分析 2.1 中华文明区域间菜issr数据的分子变异 共计46份莼菜样本来自6个居群, 分别属于华中和华东地区2个大的区域。首先, 利用不同居群莼菜ISSR数据进行分子变异 (AMOVA) 分析, 结果表明居群间遗传分子变异有显著性差异 (P0.001) (表3) 。在总的遗传变异中, 85.6%的分子变异来源于居群间, 而仅有14.4%的变异来源于居群内部。其次, 对两大区域 (华东与华中地区) 间的莼菜ISSR数据进行分子变异分析表明, 区域间分子变异的比率为81.2%, 也达到显著性差异 (P0.001) , 而来源于区域内部的分子变异仅为18.8%。采用巢式分析法 (nested analysis) 综合分析区域间、居群间以及居群内部的分子变异显示:2个大的区域间分子变异的比率为74.4%, 区域居群间变异的比率为14.9%, 区域居群内变异的比率为10.7%, 分子变异都达到显著性差异 (P0.001) 。分析结果表明这些莼菜的分子变异主要来源于区域的不同, 即不同区域自然地理特征的差异是造成其分子变异的主要因素, 其次是区域内居群间的分离产生了一定的分子变异, 而居群内部不同莼菜个体间的分子变异比率最小。 2.2 居群间遗传距离和距离分布 利用软件NTSYSpc 2.02对莼菜不同居群间遗传距离和遗传相似度比较分析, 结果显示不同莼菜居群间的遗传一致度的范围为0.69~0.99 (图1A) , 遗传距离变化范围为0.01~0.37 (图1B) 。居群LCF与居群LCY、LCZ之间的遗传距离表现最小, 为0.01;同时, 居群LCF与LCY、LCZ之间的遗传一致性最大 (0.99) ;而居群LCY与居群HZD之间遗传距离表现最大, 为0.37, 这2个居群间遗传一致性则最小 (0.69) 。值得注意的是居群之间的遗传差异化程度表现出与地理距离大小变化相关。在同一大区域内, 如华中地区3个居群之间的地理距离为22~30km (图1C-Ⅰ) , 华东地区3个居群之间的地理距离为23~113km (图1C-Ⅱ) , 各自区域内居群间的距离相对较近。比较发现区域内部居群之间的遗传距离变化范围为0.01~0.11, 遗传距离很近;其遗传一致度变化范围为0.90~0.99, 表现出很高的相似度。而在两大区域之间, 不同居群相对的地理距离为1 080~1 142km (图1C-Ⅲ) , 两两居群之间相距较远。通过比较发现不同区域居群之间的遗传距离都在0.20以上, 其变化范围为0.20~0.37, 遗传距离相对较远;其遗传一致度都低于0.90