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cody在单核细胞增生李斯特菌鞭毛运动和毒力方面的作用 cod是一个广泛存在于低g-c含量的革兰氏阳性细菌的全面随机因素。它可以调节碳代谢、氮代谢、氨基酸生物合成、外层因子运输和分解、抗生素合成、鞭毛和早芽形成等代谢途径和细胞生理过程。 单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, Lm) 是革兰氏阳性食源性致病菌。由Lm引起的疾病称为李斯特菌病, 其主要的症状为脑膜炎和败血症, 以及孕妇流产。因其高致死率 (20%~30%感染者死亡) 而被世界卫生组织 (WHO) 列入四大食源性致病菌之一 本研究通过同源重组的方法构建了Cod Y缺失突变株EGDeΔcod Y以及高拷贝质粒表达回复菌株EGDeΔcod Y+p ERL3-cod Y;比较分析了野生株EGDe、EGDeΔcod Y和EGDeΔcod Y+p ERL3-cod Y三种菌株的鞭毛运动能力、与鞭毛运动相关基因的转录表达、细菌溶血活性及主要毒力因子的转录表达差异, 从而深入探讨Cod Y对Lm鞭毛运动和毒力因子调控的分子机制。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 蘑菇和颗粒 1.2 egdeco公共资源不足 1.2.1 cogy失去了突变菌株的结构 首先采用SOEing PCR 1.2.2 ej基因的重组表达质粒 以EGDe基因组DNA为模板使用引物对P7/P8扩增出C片段 (包含cod Y基因ORF和启动子在内的1 739bp片段) , Xhol I和Bam HI双酶切后, 将C片段连接到多拷贝质粒p ERL3上, 构建cod Y基因的重组表达质粒p ERL3-cod Y。然后将其电转入EGDeΔcod Y感受态细胞中, 使用引物对P9/P10进行PCR检测和测序验证。 1.3 菌液制备及od测定 挑取待测菌株的单克隆于5ml BHI (Brain Heart Infusion, 购自BD公司) 培养基中过夜培养, 第二天, 取其1ml接入新鲜的100ml BHI培养中, 混匀后, 采用分光光度计 (Eppendorf Bio Photometer Plus) 测定菌液此时的OD 1.4 关于细菌鞭毛运动的实验 1.4.1 菌液穿刺培养 采用半固体琼脂穿刺法观察细菌鞭毛的运动性:用直的接种针蘸取少量过夜活化的菌液 (25℃, 180r/min震荡培养) 穿刺接种于BHI半固体培养基 (0.5%的琼脂) 中, 25℃静置培养一周, 每天拍照记录。如果细菌在半固体培养基中能扩散形成倒伞状结构, 则判定该细菌鞭毛具有运动性。 1.4.2 细菌鞭毛扁平运动的实验 将待测菌株过夜活化 (25℃, 180r/min震荡培养) , 取1μl菌液点样于BHI半固体平板 (0.3%琼脂) 上 1.4.3 关于赫特-pcr检测、鞭毛形成和运动相关基因的转移和发现 将待测菌液培养到对数前期OD 1.5 细菌毒剂 1.5.1 细菌溶血活性检测 参照于新惠等 1.5.2 细菌对棉扇虫的毒性实验 将待测菌液培养到OD 2 结果 2.1 egdeco公共资源不足 2.1.1 egdecody缺失片段的构建 如图1所示, 用cod Y基因两端以引物对P5/P6进行PCR扩增, 以EGDeΔcod Y为模板所得片段比以EGDe基因组为模板短约330bp, 其长度与预期结果一致, 表明EGDeΔcod Y成功缺失了cod Y基因, 同时DNA测序也进一步验证了EGDeΔcod Y构建成功。 2.1.2 以perl3-cody为模板的片段与以perl3-cody重组质粒的片段的比较 如图2所示, 用p ERL3质粒两端引物对P9/P10进行PCR扩增, 以EGDeΔcod Y+p ERL3-cod Y为模板所得片段与以p ERL3-cod Y重组质粒为模板所得片段大小一致 (2 089bp) , 与预期结果相符。表明p ERL3-cod Y重组质粒已成功电转入EGDeΔcod Y感受态细胞中, EGDeΔcod Y+p ERL3-cod Y回复突变株构建成功。 2.2 egdecody和egdecody生长阶段的差异 如图3所示, 在营养丰富的BHI培养基中, 三种菌株生长快速且生物量较高。与野生型菌株EGDe相比, EGDeΔcod Y在对数中期生长较慢, 在对数前期和稳定期的生长状况并无显著差异, 而EGDeΔcod Y+p ERL3-cod Y与EGDeΔcod Y的生长趋势一致, 并未回复到野生型水平, 推测p ERL3为多拷贝的表达质粒, Cod Y的过量表达可能会影响细菌中某些氨基酸的合成, 从而对生长产生一定的影响。 2.3 cod缺乏影响了单核细胞增多和李鞭毛运动以及鞭毛相关基因的发现 2.3.1 种菌株鞭毛生长的运动性 如图4a所示, 在BHI半固体