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铜绿假单胞菌弹性蛋白酶与肺表面活性蛋白a的关系 肺表面的活性物质是积聚在肺表面的蛋白和混合物，它们可以减少肺气-反应表面的表面张力，保护肺部免受病原体、污染物和过敏等疾病的影响。 尽管围绕Las B的大量研究取得了长足进展, 但Las B介导的蛋白裂解功能在铜绿假单胞菌肺部感染病理机制中的作用一直未见详细报道。本研究通过对PAO1野生菌株、Las B缺失突变株PDO240在SP-A体外降解和调理吞噬中的比较, 发现铜绿假单胞菌弹性蛋白酶通过降解SP-A, 破坏了SP-A介导的吞噬调理作用, 从而为铜绿假单胞菌逃避免疫吞噬提供保障。 1 lasb基因回复突变株的构建 铜绿假单胞菌野生型菌毒株PAO1由科罗拉多大学医学院Vasil博士惠赠。Las B缺失突变株PDO240 (以下文中表示为△las B, 由PAO1菌株经las B基因敲除而成) 、Las B回复突变株PDO240Las B培养基 (由PDO240菌株稳定转入野生型Las B表达质粒p KSM3构建而成) 由弗吉尼亚州立邦联大学Ohman博士惠赠。菌株于LB培养基或含60μg/m L四环素的LB培养基 (适用于PDO240Las B菌株) 中37℃培养16 h, 至A 1.2 弹性蛋白酶活性测定 C3H/He N成年雄性小鼠购于山东大学实验动物中心, 分为2组, 每组8只, 经异氟烷麻醉至熟睡状态, 分别鼻腔滴入0.05 m L含10 培养于LB的PAO1、△las B和PDO240Las B弹性蛋白酶活性采用Sensolyte 纯化的SP-A溶于缓冲液中 (5 mmol/L Tris、150 mmol/L Na Cl, p H7.4) 并保存于-20℃。PAO1、△las B和PDO240Las B过夜培养至稳定期, 洗涤后取1×10 将p UC19-GFP质粒电转入PAO1和las B使之稳定表达GFP。经过夜培养至稳定期, 取1×10 实验数据采用t检验进行统计学分析, P0.05时为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 lasb突变株与pao1野毒株感染小鼠肺内活菌数的比较 △las B菌株缺失弹性蛋白酶基因的表型分别通过Western blot分析 (图1A) 和蛋白酶活性测定 (图1B) 验证。PAO1野毒株感染的小鼠肺内活菌数的对数值达到5.976, △las B突变株感染小鼠肺内的活菌数对数值仅有4.6, 降低了1.4左右 (图2A) 。而PAO1野毒株、△las B突变株和PDO240Las B回复突变株的生长曲线无明显差别, 显示△las B突变株细菌数的减少并非由不同的生长速度引起。结果表明, △las B在C3H/Ne小鼠体内的感染毒力显著减弱 (图2B) 。 2.2 do20lab的降解 Western blot结果显示, 野毒株PAO1和回复突变株PDO240las B从6 h开始逐渐降解SP-A, 18 h后SP-A完全被降解 (图3) 。相反, 与△las B混合的SP-A始终保持完整, 显示△las B菌株丧失了降解SP-A的能力。 2.3 sp-a对lasb的调理作用 巨噬细胞吞噬细菌数目的结果显示, 随着SP-A浓度的增加, PAO1和△las B被吞噬的数目逐渐增加, 是无SP-A作用时的2.3~3.8倍 (图4A) 。PAO1和△las B对SP-A调理作用的敏感性相似, 无明显差异, 在50μg/m L SP-A作用下分别是无SP-A作用时的3.5和3.8倍。20μg/m L浓度SP-A与PAO1和△las B分别作用1 h, PAO1和△las B被吞噬的细菌数目相当, 分别为无SP-A时的3.8和3.9倍。随着相互作用时间的延长, 巨噬细胞对PAO1的吞噬逐渐降低, 18 h后, 与阴性对照已无区别。相反, △las B在与SP-A相互作用从1~18 h, 被吞噬的数目虽略有降低, 但一直维持在3倍以上 (图4B) 。 2.4 sp-a处理后pao1和lasb细菌聚集成簇的情况,其符合以下情况 在无SP-A的情况下, PAO1和△las B呈单个游离状态, 在20μg/m L SP-A的作用下, PAO1和△las B均出现大量聚集成簇的细菌。与野毒株PAO1不同, △las B在SP-A作用下聚集现象明显增强 (图5) 。 3 sp-a在铜绿假单胞菌感染中的作用 铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶Las B是一种重要的毒力因子, 在感染宿主的过程中发挥着重要的作用。在肺部感染时, 除了破坏表皮细胞联结、损伤组织外, Las B可以降解或灭活天然或特异免疫系统的成分, 包括细胞因子及趋化因子、抗菌肽、免疫球蛋白、血液补体因子以及最近报道的表面活性蛋白 此前的研究显示, 当表面活性蛋白与铜绿假单胞菌或慢性细菌感染的囊性纤维化患者