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红螯螯虾虹彩病毒对蟹类的致病作用 彩虹病毒形成了20个面体病毒颗粒，直径为120.30nm。有线性双链dna组，大小约为102.21250km，在基质中复制。 从患病红螯螯虾 (Cherax quadricarinatus) 中分离的病毒, 经鉴定, 病毒粒子为二十面体, 直径约150 nm, 病毒基因组大小估计约150 kbp, 基于病毒形态、蛋白质成分和基因组特点暂时被命名为红螯螯虾虹彩病毒 (Cherax quadricarinatus iridovirus, CQIV) 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 粗视频厚纹蟹cviv的采集 健康中华绒鳌蟹购买于福建厦门第八菜市场, 平均体重150 g.粗腿厚纹蟹采集于厦门海沧湾滩涂岩礁缝隙内, 平均体重20 g.纯化的CQIV浓度为1×10 1.1.2 pcr扩增试剂盒 获取螃蟹全基因组试剂盒购买自天根生化科技 (北京) 有限公司, PCR扩增试剂盒购自TOYOBO公司, 离心机购自德国Eppen-dorf公司, PCR仪购于香港Gene Company Limited公司. 1.1.3 引用产品 根据虹彩病毒属和绿虹彩病毒属病毒主要衣壳蛋白保守区来设计兼并引物 1.2 病毒的分离和纯度 分离及纯化方法按Xu等 (2016) 所述 1.3 养模式及分组 把螃蟹在恒温25℃, 充气泵供氧, 定时供食, 两天换一次水的条件下暂养, 5d后随机取出20只, 分为两组, 每组10只, 每5只养于一个40 dm 1.4 cqv检测 1.4.1 实时荧光定量pcr方法 感染螃蟹与对照组螃蟹取各组织各30 mg, 提取螃蟹的全基因组DNA.本实验步骤参照天根生化科技有限公司 (TIANGEN) 海洋动物基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp MarineeAnimals DNA Kits) 使用说明书.以此为模板用特异的引物进行实时荧光定量PCR. 1.4.2 实时定量pcr扩增mcp段 利用兼并引物IV-F、IV-R来扩增MCP基因片段.反应体系24 mm 2 结果与讨论 2.1 实时荧光定量pcr检测mcp基因施工 我们通过MCP片段扩增来检测病毒的拷贝数, 从基因水平上证明病毒能在螃蟹体内增值.将感染12 d的中华绒鳌蟹解剖, 取内脏与肌肉提取全基因组DNA, 以此为模板通过实时荧光定量PCR来检测是否有MCP片段扩增, 病毒标准品做标准曲线.在心脏、肝胰腺、鳃、心脏、肌肉都检测出病毒拷贝数都在1.0×10 2.2 cviv感染粗视频后细胞已感染粗视频后细胞已感染粗视频后细胞已感染粗视频后细胞已感染粗视频后细胞cviv感染粗视频后细胞,形态线确定,cviv能够感染粗视频 从海边采集粗腿厚纹蟹, 实验组和对照组各10只, 重复3次.实验组感染CQIV后第6天起螃蟹出现死亡, 摄食量减少, 感染CQIV 21d之后死亡数目达到稳定, 螃蟹存活率为46.7% (表1) .有研究表明在凡纳滨对虾 (litopenaeus vannamei) 、克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 和红螯螯虾中人工感染CQIV后都在19d内全部死亡 为了更进一步的说明CQIV能感染粗腿后纹蟹, 我们根据虹彩病毒属和绿虹彩病毒属保守蛋白MCP的基因序列设计兼并引物, 通过MCP片段扩增来检测病毒的拷贝数, 从基因水平上证明病毒能在螃蟹体内增值.将濒死的粗腿厚纹蟹解剖, 取鳃与肌肉提取全基因组DNA, 以此为模板通过实时荧光定量PCR来检测是否有MCP片段扩增, 病毒标准品做标准曲线.结果在鳃、肌肉都检测MCP片段扩增并且拷贝数达1.0×10 3 cviv对鱼类的感染 红螯螯虾虹彩病毒是一种新发现的虹彩病毒, 有文献报道该病毒能够感染凡纳滨对虾和克氏原螯虾.本研究选取具有非常重要经济和实用价值并且大规模养殖的中华绒鳌蟹和我国东海和南海海域常见野生粗腿厚纹蟹为实验对象, 通过对两种螃蟹肌肉注射红螯螯虾虹彩病毒, 利用实时荧光定量PCR技术我们发现该病毒能够感染上述两种实验用蟹.其中粗腿后纹蟹感染后死亡率达46.7%, 感染的中华绒鳌蟹内脏及肌肉都有病毒分布, 其中肝胰腺和肠富集较多.说明CQIV能够感染部分蟹类, 这也暗示着该病毒对螃蟹、凡纳滨对虾和克氏原螯虾的养殖存在潜在的威胁.目前国内感染蟹类的病原微生物大致分为:病毒、细菌、真菌和原核生物