SN_T 3084.2-2014进出口化妆品眼刺激性试验 角膜细胞试验方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3084.2--2014进出口化妆品眼刺激性试验第2部分：角膜细胞试验方法Cosmetics eye irritation test--Part 2 :Corncal cell line method2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3084.2--2014前創言SN/T3084《进出口化妆品眼刺激性试验》分为2个部分：第1部分：体外中性红吸收法；第2部分：角膜细胞试验方法。本部分为SN/T 3084的第2部分。本部分按照GB/T1.1-—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局，中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：邱璐、李小林、王艳、程树军、蒋静、潘芳、刘俊平。A SN/T 3084.2—2014进出口化妆品眼刺激性试验第2部分：角膜细胞试验方法1范围SN/T3084的本部分规定了化妆品眼刺激性角膜细胞试验方法。本部分适用于化妆品原料和成品眼刺激性体外筛选试验。本部分适用于部分化妆品使用的表面活性剂的筛选测试。本部分可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一。可以结合其他眼刺激替代试验，对眼刺激效应进行综合评价。本部分可作为其他领域眼刺激体外测试的参考方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2285化妆品体外替代试验实验室规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1眼刺激性eye irritation眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。3.2 statens seruminstitut rabbit cornea cell lineSIRC 细胞系来源于兔眼角膜组织的成纤维细胞系。3.3STE 试验 short time exposure test采用SIRC细胞进行的短时间暴露试验，本部分指5min暴露试验。4原理本试验采用来源于眼刺激靶器官的 SIRC细胞系，将样本干预细胞5 min，然后去除。采用 CCK-8细胞毒性测试法（cell counting kit-8 cytotoxicity test），使干预后的细胞与 CCK-8 试剂反应，活细胞线粒体中的脱氢酶会将CCK-8试剂还原成橙黄色的甲染料，活细胞越多，被还原成的染料越多，颜色深浅与细胞数目呈线性关系。通过测定波长450nm时的吸光度值，计算细胞的生存率，判断样品的眼刺激性。本部分为 STE短时暴露试验,适用于不同溶解性状的样本。1 SN/T 3084.2—20145仪器与试剂耗材5.1仪器5.1.1ⅡI级生物安全柜。5.1.2二氧化碳培养箱：温度37℃±1℃，湿度90%±5%,5%±1%CO²浓度。5.1.3恒温水浴箱：温度37℃士1℃。5.1.4倒置显微镜。5.1.5酶标仪。5.1.6电子大平：0.1 mg量程5.1.7细胞计数仪或血球计数器。5.1.8离心机。5.1.9混悬仪。5.1.10真空吸液泵。5.1.11程序降温仪。5.1.12液氮罐。5.1.135 μL～50 μL,10 μL～100 μl,20 μL~200 μL量程排枪5.1.14细胞冻存盒。5.2试剂耗材5.2.1MEM 培养基(minimum essential medium)。5.2.2胎牛血清（FBS）：56℃加热灭活30 min5%胰酶/EDTA溶液（Trypsin/EDTA）：0.25%胰酶溶液与0.02.mol/LEDTA溶液1：1混均。5.2.4青霉素/链霉素双抗：工作溶液青霉素（100U/mL）、链霉素（100.ug/mL）。5.2.5MEM完全培养基：含10%FBS、100U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。5.2.6二甲基亚砜（DMSO)。5.2.7细胞冻存培养基：含20% FBS.10% DMSO.的:MEM培养基。5.2.8磷酸盐缓冲液(PBS）。5.2.9矿物油：细胞培养级。%十二烷基硫酸钠（SDS)：称取0.01g SDS 于 10 mL无菌试管中,加人 PBS至 10 mL。5.2.115%吐温20(TWEEN 20):称取 0.5g TWEEN 20于10 mL无菌试管中,加人 PBS至 10 mL。5.2.12CCK-8 试剂。5.2.1350 mL无菌离心管。5.2.14无菌吸管(5 mL,10 mL)。5.2.1510 mL无菌试管。5.2.16细胞培养瓶及培养板：25cm²、75cm²培养瓶：96 孔平底细胞培养板。6试验方法6.1基本要求试验过程应符合 SN/T 2285的要求。