SN_T 1612-2013香石竹环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1612-2013代替SN/T1612—2005香石竹环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Carnation ringspot virus2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、副涂唇益真伏 SN/T1612—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1612一2005《香石竹环斑病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1612一2005相比，主要技术变化如下：增加了免疫捕获RT-PCR检测方法；—-增加了免疫电镜检测方法；一增加了实时荧光RT-PCR检测方法；一增加了香石竹环斑病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：杨翠云、于翠、胡培龙、陶廷典、崔学慧、于子翔。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1612-2005。I SN/T1612—2013香石竹环斑病毒检疫鉴定方法1 范围本标准主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS-ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。本标准适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件；仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3香石竹环斑病毒基本信息中文名：香石竹环斑病毒英文名:Carnation ringspot viru缩写：CRSV分类地位：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae），香右竹环斑病毒属（Dianthouirus）传播途径：该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。4方法原理香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性，易获得高质量的多抗血清，属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。以香石竹环斑病毒的抗血清，采用DAS-ELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛，如果样品阳性，则采用实时荧光RT-PCR、免疫电镜或者鉴别寄主反应，对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。5仪器设备、用具和试剂5.1仪器设备酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。5.2用具可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无1 SN/T 1612—2013RNaSc离心管、PCR管和研钵等。5.3主要试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。CRSV血清检测试剂、植物总RNA提取试剂盒、RNA反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见阳录 B。6病毒检测6.1样品制备将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨.并按重量和病毒抽提缓冲液1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于Eppendorf管中.离心后吸取上清液作为待测样品症状描述参见附录A。6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）按6.1方法进行样品制备获得的上清液用于DAS-ELISA检测。同时.设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作步骤见附录C。6.3免疫捕获RT-PCR方法（IC-RT-PCR）先用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加入6.1制备的上清液，进行免疫捕获，然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录D。6.4实时荧光RT-PCR方法采用6.3方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应。也可按照植物总RNA提取试剂盒的规定提取样品中的RNA，反转录后再进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录E。6.5免疫电镜方法利用香石竹环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为31nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。7结果判定样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR检测为阴性时，可判定样品不携带香石竹环斑病毒。样品经DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测为阳性时，且扩增产物序列与CRSV有高度同源性时.可判定样品携带香石竹环斑病毒。样品经DAS-EI